多组学分析揭示植食性昆虫口腔分泌物特异性诱导玉米防御反应

  昆虫作为传粉者与植物相互作用已有3.5亿多年，但同时也是植食性动物。在持续的进化期间，植物已经获得了复杂的防御系统，以感知由昆虫摄食引起的损害并相应地进行防御。目前人们对植食性昆虫相关的分子模式(HAMPs)或激发子仍知之甚少，例如昆虫口腔分泌物中的某些分子(OS)，可以被植物识别并激活特定的防御反应。在早期反应中，植物激素，包括茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和乙烯(ET))的积累在调节防御中起着重要作用。

  玉米在世界范围内作为主要作物种植，而昆虫摄食导致大量生产损失。尽管它在农业上很重要，但对玉米对植食性昆虫的反应知之甚少。本研究基于测序和质谱技术的进步，研究了玉米对机械损伤的反应，并通过将其口腔分泌物(OS)应用于伤口来模拟植食性昆虫东方粘虫Mythimna separata摄食。与机械损伤引起的反应相比，OS引起了玉米转录组，蛋白组，代谢组和植物激素更广更长时间的变化。具体来说，许多基因，蛋白质和代谢物被OS特异性诱导或抑制。来自39个家族的近290个转录因子基因参与了OS诱导的反应，其中更多的转录因子基因被OS特异性调控而不是损伤。

  材料与方法

  实验材料  

  玉米叶片：W+W、W+OS、Con各处理1.5h和6h  

  检测平台  

  转录组：Illumina HiSeq 2000 

  蛋白组(iTRAQ)：LC-ESI-MS/MS(Q Exactive-Easy nLC)  

  植物激素定量(靶标)：HPLC-MS/MS(LCMS-8040 system)  

  非挥发代谢物(非靶标)：Agilent 1200-Agilent 6510 Q-TOF  

  叶片顶空样本(非靶标)：GC-MS-QP2010Ultra

  主要研究成果 

  总共检测到52012个基因。选择了与Con对照组相比转录水平上调或下调至少4倍的基因，差异有统计学意义(q<0.05)；总共有4406个基因在所有样本中均有差异表达。处理后1.5h和6h的样品分别为1774(W+W处理后1.5h：1.5W)、1893(W+OS处理后1.5h；1.5OS)、866(W+W处理后6h；6W)和1428(W+OS处理后6h；6OS)个上调基因。在所有样本中，有572个上调基因(图1)。与Con对照组相比，W+OS处理后的前60个上调基因(1.5OS和6OS处理后各30个)以显示在log10转化后的平均表达水平。

  Figure 1. The profile of up-regulated maize transcripts.

  图1上调的玉米转录本的特征

  进一步分析了被下调至少3倍的转录本。总共发现766，1152，122个和495个基因被1.5W，1.5OS，6W和6个OS下调(图2a，b)，在所有样本中仅发现39个共同的基因(图2c)。在1.5W、1.5OS、6W和6OS的特异基因中，大多数蛋白质没有注释。相比之下，W+OS处理的样品比W+W处理的样品具有更大比例的下调基因；例如，400个基因被6OS特异性抑制，而仅有27个基因被6W特异性下调(图2a，b)。在W+W处理后1.5h和6h分别有119个和83个基因的转录水平在W+OS处理后进一步下调，其中7个基因在两次作用下都被共同调控(图2d)。1.5OS或6OS处理前60个下调基因包括细胞色素P450(GRMZM2G034471)、茉莉酮酸酯诱导基因(GRMZM2G020423)、细胞激素-O-葡糖基转移酶1(GRMZM2G074631)和各种没有注释的基因(图2e)。

  模拟东方粘虫诱导的转录组变化与机械损伤的比较表明，W+OS对玉米的影响比W+W更强，持续时间更长，表明玉米特异识别东方粘虫OS，并启动一种特异性的转录体反应。

  Figure 2. The profile of down-regulated maize transcripts.

  图2下调的玉米转录本的特征

  为了获得由W+W或W+OS处理调节的蛋白质的全局变化，使用iTRAQ技术分析前述相同叶样品(每组三个生物学重复)的蛋白质组。总共鉴定了2350种蛋白质(补充表S7)，其中294种蛋白质在处理组和Con之间或在W+W和W+OS处理之间表达水平发生变化。

  与Con样品相比，选择其水平变化至少20％且具有显着性(p<0.05)的蛋白质。15个(1.5W)，114个(1.5个OS)，33个(6W)和49个(6OS)蛋白质被上调，并且在所有处理组中仅诱导2种共同蛋白质(图3)。相对于Con，以W+OS处理上调的前60种蛋白质(1.5和6h后各30种)为研究对象，通过log2的转化，显示其平均表达水平(图3e)。这些包括NADPH脱氢酶(GRMZM2G149414)、钙依赖性蛋白激酶(GRMZM2G112057)等等。

  Figure 3. Up-regulated proteins in response to W+W and W+OS treatment.

  图3 W+W和W+OS处理引起的上调蛋白

  进一步分析了下调的蛋白质，即Con与处理组之间的蛋白质水平比至少为1.2倍，发现8、75、9和12种蛋白质由1.5W，1.5OS，6W和6OS调控(图4a，b)，所有样本中只有1种蛋白被共同调节(图4c)。在同一样本中，两次下调的蛋白质都比上调的少。与上调蛋白之间的模式类似，W+OS处理的样品比W+W处理的样品有更多的下调蛋白。由W+W和W+OS 1.5h和6h处理后，前20(对于具有少于20个特异性调节的蛋白质的样品，包括所有蛋白质)特异性下调的蛋白质在补充表S9中。经W+W处理1.5h和6h后进一步被OS抑制的蛋白质分别为45和1个，只有1种共有蛋白质(图4d，补充表S7)。对1.5OS和6OS的前60种下调蛋白进行了分析，其中包括谷胱甘肽转移酶(GRMZM2G028821)、依赖ATP的CLP蛋白酶蛋白酶亚基(GRMZM2-G056373)等等。

  Figure 4. Down-regulated proteins in response to W+W and W+OS treatment.

  图4 W+W和W+OS处理引起的下调蛋白

  在4406个调控基因中，4142个在蛋白质组数据中没有显示相应的蛋白质，可能是因为蛋白质组检测的敏感性相对较低，200个调控基因的蛋白质产物没有变化(图5a)。在蛋白质组数据中，发现1757个蛋白质没有变化，并且这些蛋白质在转录水平一直保持不变(图5)。在差异调节的294个蛋白质中，最多(214种蛋白质)转录水平没有变化，64种调控蛋白的转录本也被调控，16种蛋白在转录组中没有相应的转录本(图5)。

  Figure 5. Correlations between of proteins and transcripts.

  图5 蛋白质和转录本的相关性

  植物激素在协调植物对昆虫的抗性方面起着关键作用。因此分析了每一组中处理后不同时间采集的样品中JA、JA-Ile(JA-异亮氨酸共轭物)、SA、ABA和ET的含量。

  JA和JA-Ile水平在W+W和W+OS共同作用下迅速升高，而W+OS诱导的峰值比W+W诱导的峰值高出1倍以上(图6a，b)。值得注意的是，SA水平通过W+OS处理高度上调(W+OS处理0.5h后增加4.4倍）；相反，W+W处理过的玉米叶片中的SA水平增加不到1倍(图6c)。W+OS处理对ABA水平的影响更大，持续时间更长：在1.5h时，W+OS处理样品中ABA含量比W+W处理样品高2倍以上(图6d)。W+W处理未引起ET水平的升高，而W+OS处理的玉米叶片ET释放量几乎是CON和W+W样品的4倍(图6e)。因此，植食性昆虫东方粘虫粘虫M. separata强烈地改变了应激相关植物激素的水平。另外，进一步分析了对上述植物激素的生物合成非常重要的基因。共发现29个相关基因在不同样本间有不同程度的表达(图6f)。

  Figure 6. Changes of phytohormones and phytohormone biosynthesis-related gene expressions and proteins.

  图6植物激素和激素生物合成相关基因表达和蛋白质的变化

  特殊代谢物通常是介导对植食性昆虫抗药性的活性化学物质。因此分析了W+W和W+OS处理48h后各种非挥发性代谢产物的变化，使用UPLC-Q-TOFMS系统(每组5个生物学重复)。所检测到的代谢产物属于氨基酸、bxs、酚类、黄酮类和脂类四大类。

  与转录组和代谢组数据一致的是，W+OS处理对次级代谢产物的作用比W+W对次级代谢产物的诱导或抑制作用更强，而W+OS处理则诱导了7种代谢物，抑制了8种代谢物(图7a，b)。Bxs被认为是迄今为止发现的玉米中最重要的抗植食性昆虫化合物之一，并且通过不同的植食性昆虫摄食而受到上调。与W+W处理相比，W+OS处理对bxs的影响更大(图7c)。所有检测到的Bx生物合成相关基因均被W+W和W+OS上调，Bx10的诱导水平最高(分别为6h的130.4倍和504.5倍)，而大部分Bx生物合成相关基因在处理后6h也上调(图7d)。Bx生物合成途径中的蛋白质，BX1，BX4和Bx5在W+W和W+OS处理后6h也上调，但只增加26-45%(图7d)。此外，在玉米中，TPS1，TPS23，TPS2/3和TPS10对植食性昆虫诱导的萜烯生产很重要。因此分析了转录组数据中的所有玉米基因组注释的TPS(图7e)。

  Figure 7. Changes of maize metabolites and Bx and terpene biosynthesis-related genes and proteins after W+W and W+OS treatments.

  图7 W+W和W+OS处理后玉米代谢产物、Bx和萜烯生物合成相关基因和蛋白质的变化

  尽管W+W和W+OS处理通常诱导或抑制相对较多的TFs，但W+OS比W+W影响更多的TFs：1.5OS，1.5W，6OS和6W处理特异性上调30，14，35和0个TFs，并分别下调16，3，8和0个TFs(图8a-d)。在1.5OS和6OS(各30个)处理诱导的前60个上调的TFs中，通过log10相对于Con水平的转换来显示它们的平均表达水平(图8e)，最高诱导率为217倍(ERF，GRMZM2G544539)。W+OS处理后1.5h和6h，只有31和9个TFs被下调(图8c，d，f)，一个TALE型TF(GRMZM2G076272)受到最强烈的抑制(96.2%)。

  Figure 8. Responses of maize transcription factors to wounding and simulated M. separata feeding.

  图8玉米转录因子对损伤和模拟东方粘虫摄食的反应

  总结  

  利用多维组学方法揭示玉米对一种特殊昆虫的防御反应，并发现与机械损伤相比，模拟东方粘虫摄食是有效的。更强烈和更具体地激活玉米防御反应，突出OS在植物-昆虫相互作用中的关键性。通过1.5和6h的转录组和蛋白质组学应答，以及2d后的代谢变化。以较长的时间范围和较短的时间间隔采集的样品将提供更详细的信息，以了解玉米生理对昆虫食性的影响和调控。分析表明，与机械损伤相比，模拟东方粘虫摄食的一般规律是：(1)植物激素、转录、蛋白质组学和代谢物的变化更大；(2)上调基因，蛋白质和代谢物多于下调。因此，M. separata OS诱导了一种更强、持续时间更长的转录组和蛋白质组重排。与机械损伤相比，玉米的防御性代谢产物也大大增加。此外，玉米在咀嚼式植食性昆虫取食后，调节网发生了显着变化。

  多维分析提供了大规模的数据集，揭示了玉米在多维上对植食性昆虫M. separata的生理反应，并强调了OS在玉米抗咀嚼式昆虫中的关键作用(图9)。这些数据提供了进一步的遗传研究玉米抗虫性的框架，包括不同品种的全基因组关联研究，也为培育新的具有较强抗虫性的玉米品种。

  Figure 9. Aworking model summarizing the responses of maize to M.

  separata feeding.

  图9研究了玉米对东方粘虫摄食的响应

  点击下方原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pce.12735