RNA-seq和QTL联合鉴定野生稻幼苗耐盐有关基因

水稻

  水稻是禾本科，稻属植物，所结子实即稻谷，去壳后称大米。作为一种重要的粮食作物，世界上有将近一半人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为食。本研究以不耐盐的栽培稻和耐盐野生稻为亲本，培育出耐盐子代。运用RNA-seq和QTL定位联合分析，寻找耐盐基因。

  摘要  

  土壤含盐量是一个影响作物产量的常见非生物因素。为了从野生稻中找到增强水稻耐盐的基因，用来自湖南茶陵的野生稻作为供体，用栽培种93-11作为受体培育了一系列渐渗系（ILs)。  

  通过评估285个ILs在幼苗阶段的耐盐性，发现了一个耐盐IL：9L136。在染色体1,5,7和9~12号上发现了10个与耐盐相关的QTL，每个QTL能引起2~8%的表型变化。来自野生稻等位基因的4个QTL改善了93-11栽培种的耐盐性。

  材料与方法

  1、研究材料的培育

  2、表型评估 

  选取回交亲本93-11和285个 IL的种子消毒后在30度条件下萌发2天，选取萌发后大小相同的幼苗转移到培养液中，生长14天后，每个株系选取10棵幼苗转移到含有125 mM NaCl的培养液中，盐处理9天后，取出恢复7天，统计存活率和耐盐等级（STS）。  

  耐盐等级（STS）如下：  

  等级0：幼苗死亡或接近死亡；  

  等级1：幼苗生长显着抑制，存活率低于20%；  

  等级2：幼苗生长受到抑制，存活率在 20~~40%；  

  等级3：幼苗正常生长，存活率在40~~60%；  

  等级4：幼苗正常生长，存活率在60~~80%； 

  等级5：幼苗正常生长，存活率在80~~100%

  3、生理指标的测定  

  测定6个与非生物胁迫相关的生理学指标：脯氨酸、可溶性和丙二醛糖含量，SOD，CAT和POD酶的活性。将回交亲本93-11和较强耐盐性的9L136株系放入125 mM NaCl 培养液中，在以下时间点迅速取样（0,1,2,3,4天），然后测定生理指标，每个实验重复3次。

  4、RNA-seq分析  

  回交亲本93-11和渐渗株系9L136在盐胁迫处理后，以0h的为CK，以1h后的为ST，每个样品有3个生物学重复，共12个样品，用TRizol提取根部RNA，构建cDNA文库，用Illumina  HiSeq  2500平台测序。

  结果

  1、渐渗系幼苗阶段的耐盐性评价  

  在幼苗阶段回交亲本的STS和存活率低于IL的平均值。结果显示：回交亲本对盐胁迫更敏感，野生稻基因组中可能包含有关增强水稻耐盐性的有用等位基因。

  2、在幼苗阶段用QTL分析耐盐性  

  用142个SSR标记分析285 个IL的基因型，发现含有1358个来自野生稻的染色体片段。发现与盐响应相关的一共有10个QTL，它们位于染色体1,5,7和9~~12号上，每个QTL涉及2~8%的表型变化。

  3、渐渗系的耐盐性分析  

  为了挑选基因材料用于培育耐盐水稻品种和克隆耐盐相关基因，用6个独立实验参数鉴定4个渐渗系（9L19，9L46，9L136，9L201），渐渗系IL所携带的QTL显示这4个株系包含2个来自野生稻对耐盐有增强效应的QTL。耐盐性较强的IL 9L136携带2个耐盐相关的QTL（qST5-2和qST10），在4个株系中表现出最高的STS和存活率，平均存活率达到84%。因此9L136被选为进一步研究的耐盐材料。

  4、耐盐株系9L136的生理特征  

  一般来说，盐胁迫也伴随着渗透胁迫，导致氧化损伤和渗透物积累。检测了9L136和93-11在正常条件和盐胁迫条件下的脯氨酸，可溶性和丙二醛糖含量，以及SOD，CAT和POD的活性。结果显示：9L136株系的指标由于93-11。

  5、鉴定野生稻中与耐盐相关的候选基因  

  为了探索与耐盐相关的候选基因，用RNA-seq分析93-11和9L136在125mM NaCl处理后 0h(CK)和1h(ST)根的RNA。在盐处理下全基因组分析显示IL 9L136一共有4650个DEG，有2504个上调，有2146个下调，回交亲本93-11中一共有4291个DEG，有2173个上调，有2118个下调。进一步比较分析发现有1391个DEG只出现在IL 9L136中，暗示这些基因被盐胁迫特异性诱导。比较1391个DEG和QTL区域发现4个基因不仅被盐胁迫强烈诱导，而且显示出较高的表达水平。

  文章点评  

  该研究选用不耐盐的栽培种和耐盐野生稻为亲本，先杂交获得耐盐杂交子代，通过与栽培稻回交和耐盐筛选获得具有栽培稻背景的耐盐株系。先用生理指标分析所得株系的耐盐程度，得到渐渗系中最耐盐的株系9L136，通过RNA-seq和QTL定位，寻找与耐盐相关的候选基因。思路较常规，效果很明显。

  参考文献  

  Integrated RNA Sequencing and QTL Mapping to Identify Candidate Genes from Oryza rufipogon Associated with Salt Tolerance at the Seedling Stage[J].2017.  Frontiers in Plant Science   IF=4.298