两个优良品种籼稻的全基因组重测序

  摘要

  亚洲的栽培稻有两个亚种：籼稻品种和粳稻品种，籼稻品种在全世界的种植面积超过70%,相比粳稻具有更多的遗传变异，但至今并未公布了一个高质量的参考基因组。本研究对中国最优质的杂交稻的两个亲本珍汕97和明恢63籼稻品种进行了图位测序。基因组序列组装成237（珍汕97）和181（明恢63）个contigs，准确率超过99.99%，对应基因组的覆盖度分别为90.6%和93.2%。通过比较两个品种的基因组发现非常多的结构变异，尤其是倒位、易位、有无变异和片段的复制。大约42%非转座元件相关基因在两个基因组中被发现。三个组织的转录组分析表明1059-2217或更多基因在杂交种比亲本中表达量更高，同时杂交种中的表达的基因多样性更高，这是两个亲本之间的差异基因造成的。两个籼稻亚种高质量参考基因组的公布，对植物生物学和作物遗传学的改善将有重大意义。

  材料方法

  植物材料：籼稻品种（珍汕97，明恢63）

  基因组测序、组装：构建超过4000个BAC（两个改进的物理图谱）, 利用PacBio SMRT+>200X WGS（Illlumina）

  基因组组装结果GenBank：LNNJ00000000 (ZS97RS1) ， LNNK00000000 (MH63RS1)

  BAC序列组装的质量和完整度：MUMmer (version 3.23)，CEGMA pipeline

  着丝粒的完整度：HMMER (version 3.1b1)，构建155-165bp着丝粒卫星DNA序列的fasta文件。利用hmmsearch在两个基因组中查询，获得着丝粒位置。确定着丝粒的完整度：通过与日本晴参考基因组对应的位置、拷贝数以及着丝粒位置相比较。

  SNP，InDel识别：snpEff。（窗口100k，步移100k）

  易位、倒位识别+有无变异识别：MUMmer (version 3.23)

  转座子分析：P-MITE database、Repbase，RepeatMasker

  RNA测序和数据分析：材料（珍汕97，明恢63，杂交种），人工气候室光/暗处理分别为14h/10h，温度为32℃/28℃。RNA提取组织：四叶期的幼根、生长第三时期的花序、抽穗期的旗叶。序列组装：RSEM（reads数和基因/转录本表达水平）注：针对异构体和基因分辨不清的reads组装，reads排列：bowtie。

  编码蛋白基因的注释：SwissProt，TrEMBL，GO，KEGG，ProDom, PROSITE,

  PRINTS, Pfam, PANTHER, SMART。

  转座相关基因识别：1、Pfam数据库中筛选有注释的蛋白（转座子，转座酶，反转录酶，整合酶：通常是指细菌由于受到抗生素的攻击而自发产生的一种或多种酶，这种酶可以有效地分解抗生素之类的药物，达到保护细菌的目的。）

  2，有注释的蛋白，TBLASTN 转座子文库（E value<1e-5）

  非编码RNA预测：tRNA基因识别（tRNAscan-SE），RNAmmer预测rRNA,

  snRNA、snoRNA识别（INFERNAL在Rfam数据库），miRNA预测（首先合并深度测序的reads，用bowtie将reads mapped 每个基因组上；然后在mirbase中找到所有已知miRNA，最后用已知的miRNA分数作为阈值鉴定两个基因组中所有miRNA）

  珍汕97，明恢63的共线性分析和片段复制：MCScanX（match score, 50; match size, 5; gap penalty, –1; overlap window, 5; E-value, 1e-5），共线性基因对阈值：<1e-20.

  研究结果

  1、珍汕97，明恢63基因组参考序列的完成

  Illumina whole genome shotgun (WGS) data+ SMRT（BAC-BAC）。

  BAC覆盖率大约10X，每个BAC的原始序列大约110X；

  组装完成后参考基因组分别命名：ZS97RS1，MH63RS1；

  (WGS) data覆盖率：200X；

  2、  ZS97RS1，MH63RS1、日本晴之间的结构变异

  从外到内：外层ZS97RS1，内层MH63RS1；1层为contig,gap，2层为转座子，3层为基因密度，4层为基因表达丰度，5层为SNPs，6层为indel，7层为GC含量。

  MH63RS1有一个81kb的gap，共发现131个倒位（512-362,444bp），位于12号染色体上最大的倒位362,444bp（IV12010）。

  两个基因组染色体内和染色体间的易位（>1kb）。

  和日本晴基因组相比，MH63RS1和ZS97RS1基因组PAVs变异（>100bp，除了gap之外），ZS97RS1共有6464个特有序列（~34.2Mb），MH63RS1共有6906个特有序列（~40.3Mb）。所有结构变异加起来结果表明：ZS97RS1和日本晴亲缘关系更近。

  3、MH63RS1和ZS97RS1基因组注释

  和日本晴参考基因组相比，MH63RS1和ZS97RS1基因组中的转座元件。

  非编码RNA的个数，以及共线性关系。

  基因区域的注释：基因数目，转录本数目，外显子，非编码区大小等。

  三个基因组上转座相关基因和非转座相关基因的位置。

  MH63RS1和ZS97RS1基因的描述。

  A.转座相关基因和非转座相关基因的特点。B. MH63RS1和ZS97RS1基因组的比较。C.编码蛋白的区域InDel的长度分布。D. 受MH63RS1和ZS97RS1的SNP和InDel影响的基因。E. ZS97RS1特有区域基因的丰度。F. MH63RS1特有区域基因的丰度。

  4、由于基因组变异引起的MH63RS1和ZS97RS1的不同

  注：总的实验方案

  全文亮点：

  1、  利用三代+WGS（BAC-BAC）的测序方式构建了两个高质量高覆盖度的籼稻亚种基因组。（相比93-11）

  2、  比较了两个籼稻基因组结构，发现很多的结构变异。描述了籼稻-粳稻、籼稻-籼稻之间的共线性区域和特有区域，并详细分析了这些变异对基因的影响。

  3、  这两种籼稻基因组的公布为在分子水平阐述杂种优势的研究奠定了基础。

  参考文献

  Extensive sequence divergence between the reference genomes of two elite indica rice varieties Zhenshan 97and Minghui 63[J].Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Aug 30;113(35):E5163-71.IF=9.423