蛋白组学和代谢组学联合分析案例分享
发布日期：2019-03-19 浏览次数：6426
通过拟南芥myb28/29和cyp79B2/B3硫代葡萄糖苷突变体的蛋白质组学和代谢组学揭示硫代葡萄糖苷分子网络中的新节点和边缘
芥菜中的硫代葡萄糖苷是植物次级代谢产物，以其在动物和人类中具有强烈的抗致癌活性而闻名。在植物防御和与环境的相互作用中发挥着重要的作用。利用在硫代葡萄糖苷生物合成中重要基因的拟南芥突变体基于定量蛋白质组学和代谢组学研究鉴定出许多与硫代葡萄糖苷代谢有关的蛋白质和代谢物。这项研究为硫代葡萄糖苷代谢分子网络提供了一个全面的见解，并将有助于提高作物防御和营养价值而进行的硫代葡萄糖苷分布的工程和育种。
材料与方法
1. 样品采集
收集5周龄的WT，myb28/29和cyp79B2/B3双重突变体的叶片用液氮速冻并置于-80℃下保存。
2. 硫代葡萄糖苷的含量分析
从20mg种子或200mg新鲜叶子中提取硫代葡萄糖苷，并脱磺酸化。将其冻干分别置于100μl和60μl水中重新溶解种子和叶样品。利用HPLC系统分离在229nm处监测峰。
3. iTRAQ标记定量蛋白组学
从500mg WT，myb28/29和cyp79B2/B3的叶中提取蛋白质。检测平台：Q-Exactive Plus MS；使用Proteome Discoverer 1.4进行蛋白质鉴定并进行生物信息学分析。
4. 代谢组学分析
每个生物重复35 mg干重。检测平台：GC-MS， UPLC-MS/MS。
结果与分析
myb28/29和cyp79B2/B3突变体的分子特性，形态和化学表型
myb28/29中的T-DNA插入位点在MYB28的启动子区域的起始密码子之前182bp处和在MYB29的5'非翻译区启动密码子之前10bp处(图1A)。在cyp79B2/B3中，T-DNA插入位点在CYP79B2第二外显子起始密码子后1509bp和CYP79B3内含子起始密码子后1365(图1A)。来自突变体扩增的DNA片段的凝胶电泳与WT相比证实存在myb28/29和cyp79B2/B3的纯合双突变体(图1B)。测试的基因型的形态学检查显示myb28/29和WT之间没有明显的差异，而cyp79B2/B3植物在叶尖处出现褪绿，并且叶倾向于向下表皮滚动(图1C)。
Fig. 1. Genotyping and phenotyping of Arabidopsis thaliana myb28/29 and cyp79B2/B3 mutants.
myb28/29和cyp79B2/B3突变体蛋白质组的概述
对WT，myb28/29和cyp79B2/B3的iTRAQ标记的肽段进行分析，经过高置信度肽过滤，在两组独立实验中共鉴定了2785种蛋白质,1833个共有蛋白质，而480和472分别是实验1和实验2独有的(图2A)；基于p＜0.05和倍数变化截止值(＞1.2和小于0.8)定量到56个上调(图2B)和86个下调的蛋白质(图2C)。利用STRING来分析检测受硫代葡萄糖苷干扰的蛋白质与已知参与硫代葡萄糖苷代谢的蛋白质之间的关系。因此，在硫代葡萄糖苷分子网络中发现了新的边缘和节点(图3和图4)，将这些节点分类为初级的，在硫代葡萄糖苷代谢中起直接作用，与植物应激反应有关的次级，以及在其他生物过程中涉及的三级。
Fig. 2. Venn diagrams showing the number of identi?ed proteins and their signi?cant changes.
Fig. 3. Mapping of the signi?cantly changed proteins in myb28/29 to known glucosinolate biosynthetic pathway using STRING.
Fig. 4. Mapping of the signi?cantly changed proteins in cyp79B2/B3 to known glucosinolate biosynthetic pathway using STRING in the con?dence view.
在显着差异的蛋白质中，两种突变体之间共有36种蛋白质，其中8种上调，28种下调(表1)。基于STRING产生的分子网络(图3和4)和共有上调和下调的蛋白质水平(表1)，发现7个新的节点形成与硫代葡萄糖苷代谢有关的生物学相关边缘，包括BGL2，GSTF7，GSTF2，DRT102，MED37D，T21B14.13，APX1。这些蛋白质在压力和防御反应中是重要的，并且可以被认为是次要节点。作为硫代葡萄糖苷代谢扰动的次要作用，翻译起始因子4E(EIF4E)，30S核糖体蛋白S8(RPS8)，40S核糖体蛋白S8-1(RPS8A)和Myb结构域蛋白79(AtMYB79)在硫代葡萄糖苷分子网络形成三级节点。几种蛋白质在脂族或吲哚硫代葡萄糖苷分子网络中形成新的结点。
Fig. 5. Snapshots of the biological process-enriched GO terms using agriGO SEA
for signi?cantly changed proteins in myb28/29 andcyp79B2/B3.
用agriGO分析与WT相比显着变化的蛋白质的生物学过程(BP)，细胞组成(CC)和分子功能(MF)。在myb28/29中，注释了71个差异。SEA结果映射出121个在BP(补充图1)，33个CC(补充图2)和2个MF(补充图3)条目中富集。类似地，在cyp79B2/B3突变体中，注释了107个差异蛋白质。SEA结果映射出232个在BP(补充图3)，47个CC(补充图4)和6个MF(补充图5)条目中富集。BP中高度富集的GO条目可分为两个主要过程，即代谢过程和对刺激的反应。次生代谢过程(包括含氮和硫化合物的新陈代谢，碳水化合物代谢，吲哚，有机酸和酮类代谢)以及对胁迫的响应(包括生物和非生物刺激以及抑制反应)代表了两个突变体之间高度富集的节点(图5，补充表5)。硫代葡萄糖苷代谢过程的高度富集，对生物刺激的响应和两种突变体中胁迫的响应预测(图5，补充图1和4)。
myb28/29和cyp79B2/B3
突变体之间共有的代谢组变化
硫代葡萄糖苷水解产物3-甲基亚磺酰基丙基异硫氰酸盐在myb28/29中显示出WT水平的0.1％，在cyp79B2/B3中大约显示出WT水平的30％(图7，补充表6)。在两种突变体中，甘氨酸和甲硫氨酸水平均显示降低，而苯丙氨酸，2-羟基己二酸和甲基哌啶在myb28/29中水平降低，而在cyp79B2/B3中水平升高(图8)。作为芳香族次级代谢物的龙胆酸-5-葡萄糖苷在cyp79B2/B3中显示增加，与观察到的芳香族氨基酸代谢活性增加相一致。有趣的是，其在myb28/29中的水平降低(图8)。观察到一些γ-谷氨酰氨基酸水平升高，γ-谷氨酰基苏氨酸的增加在两个突变体中都是共有的(图9)。
Fig. 7. Changes in the aliphatic and indolic glucosinolate biosynthetic pathways in myb28/29 andcyp79B2/B3.
Fig. 8. Metabolite and protein changes in glycolysis and TCA cycle in myb28/29 and cyp79B2/B3.
Fig. 9. Metabolite and protein changes in the glutathione γ-glutamyl amino acid cycle.
总结
蛋白质组学和代谢组学已经清楚地显示了响应于脂肪族硫代葡萄糖苷生物合成(使用myb28/29突变体)和吲哚硫代葡萄糖苷生物合成(使用cyp79B2/B3突变体)的扰动的细胞分子变化的实用性。在这项研究中，鉴定了2785种蛋白质，其中142种蛋白质与WT相比在突变体中显示出显着变化。另外，鉴定了292个代谢物，并且在突变体和WT之间显示了89种不同的模式。使用STRING可以导出硫代葡萄糖苷代谢网络中的许多新的节点和边缘。数据集高度丰富了葡萄糖中毒生物合成，降解，细胞应激反应，生长和防御相关生物过程的过程。有趣的是，我们观察到吲哚硫代葡萄糖苷和脂肪族硫代葡萄糖苷的合成以及硫代葡萄糖苷和它们的水解酶之间的交叉作用。值得注意的是，减少专门的防御代谢物(葡萄糖苷酶)并不导致生长增强。这个结果可能归因于突变体中显示的细胞应激条件。
参考文献
New nodes and edges in the glucosinolate molecular network revealed by proteomics and metabolomics of Arabidopsis myb28/29 and cyp79B2/B3 glucosinolate mutants，Journal of Proteomics，2017.
