玉米转录因子的RNA-seq和ChIP-seq联合元素检测分析

  研究背景：

  Opaque2(O2)是一种转录因子，在玉米胚乳发育过程中起着重要作用。O2基因的突变可以提高玉米种子的营养价值，但也会降低农艺质量。为了揭示O2的转录调控框架，对O2突变体进行RNA-seq，并利用ChIP-seq确定O2的DNA结合区域。

  RNA-seq分析发现1605个差异表达的基因（DEGs）和383个差异表达的lncRNAs。DEGs涵盖广泛的功能，包括与营养库活性、氮代谢、抗逆性相关。

  ChIP-seq元素检测分析检测1686个O2结合位点（peaks），分布在1143个基因。RNA-seq和ChIP-seq结果中，共有35个O2调节的靶基因。我们确定了四个O2结合的motifs。其中，TGACGTGG是最保守的。我们证实，除了16-和18-kD玉米醇溶蛋白，O2直接调节其他所有醇溶蛋白的表达。O2直接调节两个转录因子，及碳和氨基酸代谢、非生物胁迫抗性相关的基因。研究建立了O2的分层调控模式，有助于理解其多种生物学效应。

  材料与方法：

  材料：Opaque2突变型（实验组）和野生型（对照组）纯合玉米胚乳。

  方法：Opaque2突变型（实验组）和野生型（对照组）纯合玉米授粉15天后的胚乳，每种3个生物学重复。

  测序策略和分析流程：

  测序：

  RNA-seq：Illumina Hiseq 2500。

  各样本raw reads 110M，约90M高质量reads，75M比对到玉米基因组。约55M reads是唯一比对的，因而有效reads比率为50%。

  ChIP-seq：Illumina Hiseq 2500，PE 100bp。

  各样本raw reads 25M，约15M reads是唯一比对的，有效reads比率为60%。

  分析：

  RNA-seq数据分析：比对：TopHat2.0.6，lncRNA鉴定：PhyloCSF platform，DEGs分析。

  ChIP-seq数据分析：比对：Bowtie2.2.3，Peak峰检测：MACS22.0.10，Peak关联基因查找、Binding Motif分析：MEME-ChIP、CHIP-seq和RNA-seq关联分析。

  研究结果：

  1、RNA-seq鉴定O2调控的蛋白编码RNAs和非编码RNAs

  A、野生型和O2突变型的差异基因数比较

  B、鉴定到的潜在的lncRNAs的序列长度分布

  C、野生型和O2突变型的差异基因比较（767个在野生型高表达、838个在O2突变型高表达）

  D、野生型和O2突变型的差异lncRNAs表达比较（125个在野生型高表达、258个在O2突变型高表达）

  E、40个DEGs的RNA-seq表达量和qRT-PCR验证表达量的差异（R2 = 0.66）

  2、O2突变造成基因表达模式的变化

  1605个差异表达的基因中，37%能被功能注释。其中，最显著相关的细胞成分（核糖体）、生物学过程（翻译延长、细胞氮复合代谢、蛋白质折叠）、分子功能（营养库活性、内肽酶抑制剂活性）如下图所示。

  3、ChIP-Seq鉴定直接由O2靶作用的基因

  A、玉米基因组中O2结合区的分布。66%位于基因区，主要位于启动子区。

  B、阳性对照基因的O2结合峰。

  C、O2结合峰的分布。转录起始位点上游1000bp至下游2000bp。主要集中在上游300bp，这与O2作为转录因子的功能相符合。

  D、维恩图显示RNA-seq和ChIP-seq结果的比较，及X2检验得到的P值。RNA-seq得到1605个DEGs，ChIP-seq鉴定到其中39个直接由O2调节的靶基因，35个下调（表1）、4个上调。O2是转录激活物。

  4、结合位点的motifs分析揭示O2新的顺式作用元件

  A、13个之前报道的O2结合位点。强调ACGT。

  B、6XHis-O2融合蛋白，从O2靶基因的启动子区域分离的探针的EMSAs（电泳迁移率分析）。包含之前报道的13个O2结合位点。箭头表示O2和O2结合元素复合物的形成。

  C、通过MEME-ChIP针对所有peak上下游1kb探索新的O2结合motif，其中TGACGTGG是最保守的。

  D、从O2靶基因的启动子区域分离的探针的EMSAs（电泳迁移率分析）。O2结合TGACGTGG甚至比以前报道的更强。

  5、O2直接调节不同的醇溶蛋白

  ChIP qPCR实验验证证实体内O2结合醇溶蛋白启动子区域的活性

  A、anti-O2为抗体，IgG是抗体对照。引物分别来自b-32、cyPPDK1、ubiquitin。

  B、O2与不同玉米醇溶蛋白启动子区域的结合，都显著富集。

  O2作为不同玉米醇溶蛋白的转录激活因子。

  A、在洋葱表皮细胞进行双荧光素酶瞬时转录活性测定。花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子驱动的O2作为effector，LUC（由玉米醇溶蛋白驱动的萤火虫荧光素酶基因）作为reporter。

  B、O2诱导（z1A、z1B等启动子）LUC的表达。LUC/REN指醇溶蛋白启动子的相对活性。

  6、O2直接调节其他转录因子

  对35个潜在的O2靶基因进行双荧光素酶瞬时转录活性测定。发现Myb-like和GBF1是O2靶基因。

  7、O2调节氮代谢、抗逆性相关的基因

  A、CyPPDK1、2是糖酵解途径的主要调节因子。乳酸酰谷胱苷肽裂解酶（LGS）有细胞解毒和抗非生物胁迫的作用。

  B、两者均由O2显著诱导。

  C、LGSs均由O2直接调控。

  8、O2在全基因组分层次的转录调控框架

  O2是玉米胚乳发育过程中多种代谢途径的中枢调节，直接或间接地影响基因转录。全基因组转录调控网络显示，O2不仅直接激活相关基因，还控制转录因子，进而调节植物代谢。

  亮点分析：

  本研究采用RNA-seq和CHIP-seq数据关联分析，分别从整个转录水平和全基因组水平研究Opaque2突变型玉米的表达情况，并搜索O2在全基因组水平的DNA位点情况，联合两者分析揭示差异基因是否为O2所调控。

  参考文献：

  Genome-Wide Characterization of cis-Acting DNA Targets Reveals the Transcriptional Regulatory Framework of Opaque2 in Maize.

  2015-The Plant Cell-9.338