玉米苗期抗旱基因ZmVPP1的遗传变异

  摘要

  全世界的玉米产量受到干旱胁迫的威胁。玉米干旱的潜在遗传因子的识别是非常重要的。本研究报道了玉米苗期干旱胁迫的全基因组关联分析鉴定到83遗传变异位点，解析至42个候选基因与抗性相关。在玉米 ZmVPP1位点检测到GWAS的峰值信号，该基因编码液泡膜上的质子泵-焦磷酸水解酶，对抗旱具有显著的作用。进一步研究发现，在该基因的启动子区域有一段366bp的插入，其中包括3个干旱应答的MYB顺式作用元件。转基因玉米增强了ZmVPP1的表达量，从而提高了抗旱特性。原因可能是增强了植株的过合作用效率和根的生长发育。这些信息为玉米干旱胁迫的自然变异提供了重要的遗传学见解，鉴定到的位点或基因能够直接用于玉米性状改善的选择或遗传学的选择靶点。

  材料方法

  参考基因组：B73（干旱敏感型）。

  BAC文库：CIMBL55（耐旱型）。

  （之前研究报道）重组自交系：367株系，种植每块地：（6 × 1.4 × 0.22 m, length × width × depth）；5吨土+0.25吨鸡粪；土壤相对含水量约为40%；每块地分成460个点，四周的82个点种成保护行；随机播种，每个实验每个点同一基因型种植12株，保证土壤饱和含水量至玉米三叶期，随后控制水分供给，并每天检测土壤含水量；当第一片叶发生萎缩的症状出现，记录时间；大约6天之后土壤含水量接近为0（此时整个幼苗全部萎蔫），重新开始浇水救活植株；然后在干旱处理一周，再水化；记录每种基因型的存活率；幼苗为绿色且能养活作为幸存者。

  PCA：EIGENSTRAT （525,104 SNPs，最小等位基因频率MAF≥0.05）。

  挑选140份具有代表性的材料：设计引物对ZmVPP1进行测序。

  序列组装、排列：DNAMAN、MEGA 5.0；

  GWAS分析： Tassel 3.0。

  转录组分析：60k Agilent Maize Oligo Microarray (AgilentTechnologies)，49041个转录本相应脱水处理。

  Gene FD>1.5，P<0.05被认为是显著上调或下调。

  RNA提取：TRIzol reagent（每个基因型3颗幼苗）。

  qRT–PCR：SYBR Premix Ex Taq kit ；maize Ubi2作为内参对照。

  研究结果

  1、玉米苗期干旱胁迫的GWAS研究

  不同株系的存活率统计。

  367个株系：152个热带/亚热带（TSS），149个温带（软秆NSS,硬秆SS），66个混合来源（MIXED）。

  和玉米干旱胁迫显著相关的ZmVPP1自然突变。

  a，黑色圆点代表SNP；红色三角形:InDel-379（366bp）；黑色三角形：InDel-123（5bp）蓝色圆点、三角形：非同义突变（SNP7、InDel-379（6bp））。

  b，140种玉米 ZmVPP1自然突变的单倍型。

  c，抗旱和敏感型 ZmVPP1相对表达量。抗旱：Hap3, Hap4；敏感：Hap1, Hap2。

  MLM：混合线性模型（计算群体结构导致的假阳性+群体自然变异的家族亲缘关系）；GLM：一般线性模型

  红色表示候选基因位点SNP。

  a,考虑各种变异因素（协变量）的条件GWAS。

  c, 热带/亚热带玉米GWAS。

  e,温带软秆玉米GWAS。

  42个候选基因注释信息。

  9号染色体上，5个显著相关SNPs位点都在基因GRMZM2G170927的3’UTR区域。

  2、ZmVPP1是和耐旱性显著相关的基因

  红色、蓝色箭头分别代表ZmVPP1、GRMZM2G170927的基因区域；空箭头：转座子；带数字方框：同源区段；淡蓝色线：共线性关系。

  3、ZmVPP1作为一种质子泵-焦磷酸水解酶的功能

  a（上）,拟南芥两种突变体中CIMBL55、B73（ZmVPP1）的蛋白杂交。（下）拟南芥叶片总膜蛋白对照。b,拟南芥突变体和CIMBL55、B73（ZmVPP1）转基因的表型对比；VC-1、VC-3为空载。（c~i）空载和CIMBL55、B73（ZmVPP1）转基因的对比。c,蛋白杂交对比；d,侧根发育对比；e, 质子泵-焦磷酸水解酶活性对比；f, 侧根发育对比；g,根干重的对比；h,液泡PH的对比。

  i：干旱胁迫的评估。

  结果表明：ZmVPP1是一种质子泵-焦磷酸水解酶，ZmVPP1的过表达能够提高根系的发育和植株的耐旱性。

  4、366bp插入对ZmVPP1（CIMBL55）抗性的影响

  不同长度的ZmVPP1启动子，GUS表达水平。ZmVPP1（CIMBL55）的366bp插入片段包括3个MYB转录因子；mMYB为转座子的突变类型；AtMYB2：MYB转录因子基因。

  外施ABA或AtMYB2共表达，由ZmVPP1（CIMBL55）启动子驱动的GUS基因表达量显著上调。3’UTR区域诱导GFP表达水平无明显变化。插入片段中的MYB结合序列是引起ZmVPP1（CIMBL55）响应干旱胁迫的原因。

  5、ZmVPP1胁迫等位基因能够提高耐旱性

  耐旱等位基因：NIL- CIMBL70/NIL- CIMBL91；敏感型等位基因：NIL-Shen5003。

  a/b,正常浇水和干旱处理下三种材料的表型；c,对三种材料插入片段的检测；

  d,三种材料的存活率比较；e/g/h,ZmVPP1的相对表达量（不同处理下）。

  ZmVPP1（CIMBL55）的耐旱等位基因的选择同样能提高植株的耐旱性。

  6、过表达ZmVPP1能够提高耐旱性

  b,（上）ZmVPP1（B73）蛋白杂交（野生和转基因植株）；（下）

  Ca2+对质子泵-焦磷酸水解酶的抑制作用。

  7、转基因玉米的光合作用和产量

  a,不同干旱处理时间野生型和转基因玉米的光合速率、气孔导度、蒸腾速率、水分利用率；

  b,ASI：雌雄开花间隔天数；HKW：百粒重；每株的产量（正常给水、干旱处理）。

  8、不同植物中ZmVPP1的遗传进化分析以及旁系同源基因的表达量

  结论亮点

  1、利用GWAS以及后期的工作将玉米耐旱相关位点解析至42个候选基因（能够解释55.2%表型变异）；其中18个能注释到压力胁迫相关的生物学通路，22个基因的表达相应干旱胁迫。

  2、成功克隆了耐旱材料CIMBL55的ZmVPP1基因，通过与敏感型的玉米参考基因组B73比较发现在ZmVPP1基因的5’UTR一个包含3个MTB转录因子的366bp片段的插入；并通过转基因证实这个片段的插入是影响玉米耐旱性的主因。而3’UTR对耐旱性提高无明显效应。编码区的SNP7、InDel-158两个非同义突变在转基因拟南芥中并不影响质子泵-焦磷酸水解酶的活性。

  3、证实ZmVPP1的等位基因及过表达该基因均能显著提高植株的耐旱性。

  参考文献

  Genetic variation in ZmVPP1 contributes to drought tolerance in maize seedlings [J].Nat Genet. 2016 Aug 15. doi: 10.1038/ng.3636.