缺氧导致鱼类繁殖的跨代损伤

  摘要：

  缺氧是水环境中最广泛和最紧迫的问题之一。本文的研究表明，海洋青鳉鱼（Oryzias melastigma）缺氧后，导致F1和F2代的生殖障碍（性腺发育延缓、精子密度减少、精子活力降低），尽管这些后代（和他们的生殖细胞）从未暴露于缺氧环境。进一步研究表明，跨代的生殖障碍与F0、F2的精子特异基因的差异甲基化模式有关，相关的转录组和蛋白质组的改变可能影响精子的发生。所发现的遗传和表观遗传的影响表明，缺氧可能对鱼类种群产生一个巨大而持久的威胁。调节精子发生的基因和表观遗传修饰在脊椎动物中是高度保守的，这些结果同时也揭示了缺氧在其他脊椎动物中潜在的遗传效应，包括人类。

  材料与方法：

  材料：海洋青鳉鱼

  取材方法：性成熟的海洋青鳉鱼保持在常氧（normoxia）或缺氧（hypoxia）培育一个月。常氧的F1、F2代受精卵的仍保持常氧培育。缺氧组的受精卵在受精1h后收集，并分为两类，一类恢复常氧培育，并持续两代。另一类仍缺氧培育两代。

  测序策略和分析流程：

  测序：Illumina HiSeq 2000

  分析：测定睾丸组织学改变、精子活力和受精成功率，分析精子的DNA甲基化模式（使用甲基化DNA免疫沉淀测序、MeDIP Seq），分析F0、F2代常氧、缺氧和跨代组的睾丸的差异表达基因（RNA-seq）和蛋白质组（采用Western blot和iTRAQ定量测定）。

  研究结果：

  1、F0、F1、F2代生殖功能障碍。

  a、实验设计。

  b、F0、F1、F2代的精子活力。N、T、H代表常氧、跨代、缺氧组。VAP、平均路径速度；VCL、曲线运动速度；VSL、直线运动速度。

  可见，即使未缺氧，F1T、F2T的精子活力也明显下降。

  c、睾丸重量比较分析。

  d、精子细胞比例比较分析。

  2、F0、F1、F2代睾丸中缺氧诱导的蛋白表达差异（DEPs）。

  同位素标记相对差异绝对定量（iTRAQ）共鉴定出5452个蛋白质。

  a、DEP统计。X轴代表差异表达蛋白的数量。Y轴代表了不同世代的比较组。

  b、层次聚类的热图。所观察到的跨代影响与F0亲本缺氧相关。

  3、缺氧诱导跨代的转录组变化。

  RNA-seq在跨代组中发现EHMT2二甲基化。

  a、维恩图显示F0H-F0N、F2T-F2N、F2H-F2N之间显著上调或下调的基因。

  b、聚类图显示F0H、F2H、F2T中基因的表达聚类。红色和蓝色条代表的上调和下调。

  c、常染色体组蛋白3上第9个赖氨酸的N-甲基转移酶2（EHMT2）、蛋白酪氨酸激酶2B（PKT2B）和丝裂原活化蛋白激酶9（MAPK9）通过qRT-PCR的表达差异验证。

  d、睾丸组织的免疫组化显示。阳性细胞由褐色的着色显示。免疫组化进一步证实F1和F2的跨代和低氧组的H3K9me2阳性细胞增加。

  4、缺氧对跨代的表观组影响。

  a、采用液相色谱-串联质谱法，分析5 -甲基胞嘧啶占总胞嘧啶的比例。

  b、差异甲基化区域（DMRS）在染色体的分布。高甲基化和低甲基化的区域分别用红色和绿色表示。

  c、差异甲基化区域（DMRS）聚类分析。F2T和F0H接近。

  5、多组学联合分析。

  a、IPA整合了跨代影响的表观组、转录组和蛋白质组水平，分别由椭圆形、六边形和矩形符号表示。黑色和白色的圆点分别表示高甲基化和低甲基化。粉红色和绿色分别表示基因或蛋白质的表达变化。

  b、缺氧引起精子的甲基化改变，并改变与精子发生或基因沉默相关的基因、蛋白的表达，导致从未被暴露于低氧的F1和F2代精子活力降低和精子数量减少。

  亮点分析：

  本文通过组织学、表观组学、转录组学、蛋白组学联合分析，表明缺氧可能对鱼类种群造成巨大而持久的威胁。此外，因为表观变化（尤其是蛋白编码基因的CG甲基化）在动物中是高度保守的，本研究对于未来生物医学研究也有所指引。例如，高海拔和睡眠呼吸暂停引起的低氧胁迫也可能导致类似的表观遗传学改变和人类跨代的生殖障碍。

  参考文献：

  Hypoxia causes transgenerational impairments in reproduction of fish.

  NATURE COMMUNICATIONS. 2016, IF= 11.329