莲的线粒体基因组揭示古老的进化特征

发布日期：2019-03-19 浏览次数：3591

摘要

莲是一种白垩纪晚期的进化遗迹。针对莲的线粒体基因组进行测序是一种对真双子叶植物（花粉具有三孔的植物类群）的进化历史阐述的重要方案。本文对莲的线粒体基因组进行SMRT平台测序，并对叶绿体基因组进行de novo组装以及注释。结果共组装出524,797bp莲的线粒体基因组，共包含65个基因，其中40个编码蛋白的基因、3个rRNA基因以及20个tRNA基因。由15个共线性基因构成的基因簇在不同的植物品种中是保守的。在编码蛋白的基因中鉴定到大约700个RNA编辑（在mRNA水平上改变遗传信息的过程，包括插入、删除和替换一些核苷酸残基）位点。通过选择压力分析对正选择的基因进行识别，鉴定到来自叶绿体的19个片段和7个tRNA。这些结果表明莲的线粒体基因组在进化过程中是保守的，包括古老的基因和基因簇、高水平的RNA编辑位点和低水平的来源于叶绿体基因组的插入片段。作为第一个公布的基础真双子叶植物的线粒体基因组，对今后真双子叶植物的进化研究提供重要的研究基础。

材料方法

实验材料：湖北武汉磨山植物园莲种子，室温暗室中发芽。白化幼苗（不连续的蔗糖密度梯度离心法+脱氧核酸酶I体外裂解）分类线粒体DNA。利用三对细胞核、叶绿体和线粒体特异的引物对提取的DNA纯度进行半定量。

测序策略：20ug 线粒体DNA进行SMRT建库（20Kb），测序平台：PacBio RS II（3个 SMRT cell）

基因组组装：原始reads过滤和校正：SMRT Analysis 2.1（用短序列比对到长种子序列（6000bp）），用Blat将reads比对到莲的叶绿体基因组（GenBank:KM655836）和NCBI的叶绿体基因组数据库，过滤掉叶绿体reads（>90%）；超过8000bp的reads用来组装（Celera Assembler 7.049+MIRA4.0rc5）。

基因组注释：NCBI-BLASTN（叶绿体插入），NCBI-BLASTX（ORF预测）比对数据库；tRNA鉴定：tRNAscan-SE；线粒体图谱绘制：Genome Vx。SSR识别：MISA。

线粒体基因组基因共线性分析：与其他37种代表性被子植物的线粒体基因组（NCBI）进行BLASTP/BLASTX比对。

编码蛋白基因的RNA编辑分析：总RNA提取：幼嫩叶片CTAB。反转成cDNA，设计引物扩增cDNA，纯化后（或连接到pMD18-T载体）进行一代测序。与基因组测序结果比对：ClustalW（MEGA5）。

系统发育分析：（最大似然法）RAxML-HPC v8.1.2。

选择压力分析：PAML（program Codeml）。

叶绿体插入片段：BLASTed 莲的叶绿体基因组。（同源相似度>80%，长度>90%）

研究结果

1、莲的线粒体DNA提取