柑橘无性繁殖的基因组研究

  摘要  

  孤雌生殖的出现是一种由有性生殖到无性生殖的转变，是现代柑橘类果树的一个很明显的特征。本文针对4个柑橘属品种进行de novo测序并对其基因组进行全面的研究。另外对100个古老品种、野生种及栽培柑橘属品种进行测序，群体比较研究表明栽培柑橘的能量代谢和生殖相关的基因受到明显的选择。研究将柑橘多胚胎性状的遗传区间缩小到一个包含11个候选基因的80kb范围内。其中CitRWP在多胚胎柑橘中表达量较高，在该基因的启动子区域有一个小的反向重复的转座子插入，而且与多胚胎性状是共分离的。本研究对柑橘的孤雌生殖和重要农艺性状的基因发掘提供了新的思路。

  材料方法  

  植物材料：古老品种、野生种及栽培柑橘属品种（100个），平均33.9X；BSA测序：HB pummelo × Fairchild mandarin（217 F1），各20株单胚和多胚进行混池，亲本测序10X，混池60X；de novo测序：雪柚（Citrus grandis）：30cell（56.8X）+141G Illumina（370.3X）；酒饼簕（Atalantia buxifolia）：3.73G SMRT Cell（11.4X）+131.9G Illumina（401.9X）；宜昌橙（citrus ichangensis）：63.4G（164.4X）；香橼（citrus medica）：69.5G（170.9X），Illumina文库（140-500bp，2k，5k，8k，8-10k，20k）；PacBio long reads组装：SMRT Analysis (v2.3.0)：Hierarchical Genome Assembly Process (HGAP)；Illumina reads：SOAPdenovo，校正：QUAKE。  

  RNA-seq：26个样品（叶片，配珠，果实，种子），2个生物学重复，Illumina Genome Analyzer（平均4G）；qRT-PCR：ABI 7900。内参：β-actin gene。  

  柑橘亚族进化树：RAxML software（GTRGAMMA model）。  

  编码蛋白基因注释：BLASTP，同源基因聚类：OrthoMCL。

  研究结果

  1、  柑橘亚族的系统发育和繁殖系统

  a，8个柑橘亚族物种的系统发育树；b，柑橘属古老、野生和栽培品种的果实和种子重量的比较（每行左边为幼小果实，右边为成熟果实，中间线的长短表示种子重量大小）

  2、  柑橘亚族基因组的测序和组装

  雪柚的基因组测序文库及数据统计（另外三个略）

  雪柚的基因组组装结果统计

  蓝色：遗传图，红色：组装的scaffold

  3、 柑橘属的基因组特征

  从内到外：1、基因密度；2、GC含量；3、柚子和克莱门氏柑橘的共线性区间；4、克莱门氏柑橘的SNV密度；5、柚子和大翼橙间的共线性区间；6、大翼橙属的SNV密度；7、柚子和酒饼簕间的共线性区间；8、酒饼簕的SNV密度；9、柚子的染色体。

  4、  柑橘属遗传多样性和群体比较分析

  a，古老、野生和栽培的柑橘属品种。b，45个柑橘属品种的系统进化树（15酒饼簕，11大翼橙，19柚子）。c，酒饼簕，大翼橙和柚子的核酸序列多样性。酒饼簕序列多样性最大，柚子最小。d，酒饼簕和柚子相比序列多样性的变化。π ratios ：πatalantia/πpummelo。

  9号染色体上柚子受到选择清除的区间13.8-14Mb（15个基因：细胞色素c生物合成、线粒体蛋白、ATP合酶、NADH脱氢酶、线粒体核糖体蛋白）

  5、  柑橘属孤雌生殖的遗传基础

  a，柑橘和柚子的单胚和多胚性状。b，对多胚性状的BSA分析。（定位到23.695-25.655Mb区间）c，Fisher test精细定位到4号染色体上显着相关区域80K的基因注释。

  a，多胚和单胚材料在目标区间的核酸多样性分析。b，多胚和单胚的选择性清除分析。c/d，单胚位点和多胚位点的连锁不平衡分析。

  a，SNP和表型的相关性分析（Cg4g018910，Cg4g018970）。b，甜橙Cg4g018970在不同组织中的相对表达量。c，Cg4g018970在单胚（柚子、香橼、克莱门氏柑橘）和多胚（西柚、柠檬、椪柑）中的相对表达量。d，Cg4g018970（CitRWP）的基因结构：编码区上游（MITE转座子），星号：和多胚性相关的SNP。e/f，柑橘属植物中CitRWP MITE的检测。

  6、  柑橘属性别和胚胎形成的转录组分析

  a，柚子（多胚）和甜橙（单胚）在叶片、胚珠、果实和种子中的特异表达基因热图。b，多胚和单胚材料的胚珠间差异表达的基因。c，和胚珠数相关的基因，蓝色：胚珠中高表达，但单胚和多胚间无差异；红色：胚珠中高表达，且单胚和多胚间有差异。

  研究亮点  

  1、  针对柑橘属的四种不同果树进行de novo测序，分析了两两之间全基因组范围内的共线性关系，将柚子组装结果锚定到遗传图上，并对柑橘族的8个品种进行系统发育。  

  2、  统计了柚子、大翼橙、酒饼簕全基因组范围内的序列多样性和选择性清楚分析，并对受选择的区域进行功能基因的注释。  

  3、  对柑橘属的多胚性进行BSA定位，结合自然群体的Fst分析将候选基因锁定在柚子4号染色体的80K区间内。通过qRT-PCR验证，找到表达量最高的候选基因Cg4g018970（CitRWP），对基因中和表型紧密连锁的MITE转座子进行群体材料的验证，以及RNA-seq测序结果均支持Cg4g018970（CitRWP）是多胚性的候选基因。