红枣基因组测序及果实甜酸味的进化研究

  摘要  

  红枣是属李科的一种具有重要经济和营养价值的果树品种。本文公布了红枣品种“junzao”的基因组草图，并且对不同地理位置的31个不同的栽培和野生种进行重测序。比较基因组学结果表明新鲜的红枣“Dongzao”的基因组比“junzao”大~86.5Mb，部分原因是近代的转座子插入事件发生引起的。本文重建了鼠李科和蔷薇科共同祖先的8条染色体，并阐述了现代红枣基因组形成的进化过程。群体结构分析表明红枣复杂的遗传背景源于红枣与它的野生亲缘物种间的广泛杂交。尤其是一些控制果实有机酸代谢和糖分含量的基因是显着受到选择性清除的。本文同样发现控制红枣自交不亲和性的S基因（植物受粉中支配花粉和花柱性质的基因，它决定着可育性和不育的性质。），同时针对红枣的S基因的单倍型进行分析，为红枣杂交育种的亲本选择提供参考。本研究为红枣的改良提供了有价值的基因组信息，同时也对红枣基因组的进化及其群体结构和驯化给出了一个自己的见解。

  材料方法  

  植物材料：生长9年，高度杂合的二倍体红枣品种（Junzao）；  

  基因组大小评估：流式细胞仪。  

  Junzao de novo测序：全基因组鸟枪法策略；基因组DNA提取：幼嫩叶片（Qiagen DNeasy Plant Mini Kit ）；总共3ug DNA用于文库构建；小片段PE文库（180,500bp）NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina；大片段文库（2,5,10,15,20kb）Cre-Lox recombination；测序平台：Illumina HiSeq 2000；测序深度：227X。基因组组装：SOAPdenovo。  

  Junzao、Qingjiansuanzao转录组测序和表达分析：韧皮部，成熟叶片，花，果实（果实变大、半红、全红时期）总RNA提取（CTAB）；测序平台：HiSeq 2000/2500。  

  基因预测：1、Augustus , Geneid , Genscan , GlimmerHMM , SNAP；2、用TBLASTN（E-value=1e-5）将拟南芥、甜椒、柑橘、苹果、巨桉树、水稻、毛果杨、葡萄的蛋白序列比对得到组装的Junzao基因组上；Junzao同源的基因组序列准确的拼接比对蛋白序列：GeneWise；3、36G高质量RNA-seq reads 比对Junzao基因组（TopHat），然后用Cufflinks对基因的结构进行预测。 

  遗传图构建和基因组scaffold的锚定：1、Rapid SNP discovery and a RAD-based high-density linkage map in jujube (Ziziphus Mill.). PLoS ONE 2014；2、构建了另一个包含96个子代的F1群体‘Dongzao’ × ‘Yingshanhong’,Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.PLoS ONE 2008。 

  进化树构建：RAxML（最大似然法）；物种分化时间：PAML-McMctree；  

  Junzao和Dongzao的共线性分析：MUMmer package。重复元件识别：RepeatMasker。  

  重测序及SNP识别：31个红枣品种（10野生+21个栽培）；测序平台：Illumina HiSeq 2500/4000；平均测序27.8X；clean data 比对Junzao基因组：BWA；SNP识别：SAMtools。  

  红枣自然群体进化树及群体结构分析：NJ树（Treebest-1.9.2）；PCA分析：EIGENSOFT；群体结构分析：FRAPPE（K=2-5）。 

  选择性清除分析：θπ ratios，pairwise population differentiation (Fst)，Tajima’s D，cross-population composite likelihood ratio test (XP-CLR)。

  研究结果

  1、Junzao基因组测序、组装及注释

  比较Junzao和Dongzao的基因组组装结果，Junzao基因组更小且组装效果更好。

  利用两个遗传图谱将组装好的600个scaffold锚定到12个连锁群上，共293Mb（占基因组的83%）。

  Junzao基因组中3种不同方式预测到的编码蛋白的基因。

  Junzao基因组中的杂合SNP位点识别。

  2、Junzao和Dongzao基因组的比较

  Dongzao没有锚定到连锁群上的基因数远远超过Junzao。

  3、鼠李科、蔷薇科基因组的进化关系

  依靠桃、苹果和红枣的基因组序列对蔷薇目的（鼠李科、蔷薇科）的7个物种的祖先染色体进行推测。

  4、红枣群体结构分析

  A,利用31个红枣的全基因组SNP构建NJ树。B、C,群体PCA和群体结构分析。

  5、红枣群体驯化和差异分析（选择性清除）

  A,野生、栽培红枣有机酸和糖分在不同生长时期的含量变化。B,4种选择清除的指标下受选择区域基因数的韦恩图。C，红枣糖和有机酸的细胞内代谢途径（细胞质、线粒体、液泡）；每行6个小方框代表一个基因不同时期的表达丰度（从左到右：野生品种，果实扩大、半红、全红3个时期；栽培品种，白色、半红、全红3个时期）。

  6、红枣S基因识别

  Junzao和Dongzao中的各3个S候选基因。

  A, Junzao和Dongzao中的各3个S候选基因及其他S基因的进化树构建。B, Junzao的3个S候选基因在不同组织中表达分析（S-Rnase基因S1在花中特异表达）。C,1号染色体上S-Rnase位点附近的SFB基因（都不是花中特意表达）。注：配子自交不亲和是由花柱中S基因S-Rnase及花粉中SFB基因共同决定的。D,32种红枣资源S单倍型的频率分布。

  结论亮点  

  1、构建干枣品种“junzao”的基因组草图，比较基因组学结果表明新鲜的红枣 “Dongzao”的基因组比“junzao”大86.5Mb，部分原因是近代的转座子插入事件发生引起的。并且对不同地理位置的31个不同的栽培和野生种进行重测序。对这些品种进行遗传进化和群体结构的分析。  

  2、重建了鼠李科和蔷薇科共同祖先的8条染色体，并阐述了现代红枣基因组形成的进化过程。群体结构分析表明红枣复杂的遗传背景源于红枣与它的野生亲缘物种间的广泛杂交。尤其是一些控制果实有机酸代谢和糖分含量的基因是显着受到选择性清除的。  

  3，发现控制红枣自交不亲和性的S基因，同时对重测序的31种红枣针对S基因的单倍型进行分析，为育种的亲本选择提供基础。

  参考文献  

  The Jujube Genome Provides Insights into Genome Evolution andthe Domestication of Sweetness/AcidityTaste in Fruit Trees.[J]PLoS Genet. 2016.IF=6.661