通过核糖体分析和RNA-seq了解拟南芥长期热应激的适应性反应

  摘要：

  背景：环境压力使生物面临风险，需要特定的适应机制，以最大限度地提高生存。长期面临环境压力，需要细胞全面的重新调整不同的基因表达水平。

  结果：本文使用核糖体分析和RNA测序，全面地研究长期的热应激下，拟南芥的适应性反应。为了适应长时间的热应激，许多基因在转录和翻译水平的表达均以协调的方式调制。然而，有一组基因明显不符合这一趋势，主要是翻译调控。不同的二级结构可能在调节这些基因的翻译调控中发挥作用。

  结论：实验数据还揭示了质体中多亚基蛋白复合物的亚基化学计量，如何在热应激时维持不变。

  材料与方法：

  材料：野生型拟南芥Col-0。

  取材方法：野生型拟南芥Col-0在温室中较长光照下生长（16h 光照、8h 黑暗），湿度60%。将15株抽薹前的，3周大的植株的叶子暴露于37℃ 3h，对照组处于22℃。收集植物叶片，液氮速冻，提取RNA。

  多核糖体分析：10g的叶片材料解冻后放入多核糖体提取液中，用玻璃匀浆器匀浆，用四层无菌奶酪布和两层米拉布过滤，冰上孵育10min。上清液4℃离心后，再次过滤，转移到蔗糖缓冲溶液，4℃离心3h。含核糖体的颗粒会悬浮在冰的悬浮缓冲液中，分别用于15-60%的蔗糖梯度，4℃离心1.5h。纯化的核糖体用RNAse I消化10min（22℃），直接加载到15-60%的蔗糖梯度，4℃离心1.5h。用热酸-酚处理法，提取RNA，用RiboMinus Plant Kit (Ambion)去除rRNA。采用Trizol试剂盒提取总RNA，也用RiboMinus Plant Kit (Ambion)去除rRNA，随机分散在碱性裂解液中裂解，回收沉淀。各设两个生物学重复。

  测序策略和分析流程：

  测序：Illumina HiSeq2000。

  分析：比对到拟南芥参考基因组：Bowtie；

  差异表达分析：DESeq；

  鉴定序列的保守motif：MEME；

  结果：

  1、 植物适应热应激的基因

  在转录或翻译水平的相当大部分基因的表达变化。

  A、实验设置方案。每组15个植物。

  B、利用DESeq进行差异表达分析。mRNA表达变化的基因被指定为蓝色，RPF（核糖体片段）表达变化（mRNA表达不变）的基因被指定为红色，mRNA和RPF表达都变化的基因被指定为绿色。热应激下每个组中的上下调基因数被列举在图中。

  在转录和翻译水平上调最突出的主要是参与了热应激反应和蛋白质折叠（如伴侣蛋白和热休克蛋白）的基因。有趣的是，虽然植物热应激3小时，应该引起的热应激的适应性反应，但关键热休克蛋白的mRNA含量非常高。相反，与染色质结构、细胞骨架、细胞壁的合成、细胞周期和合成过程相关的基因在转录和翻译水平大多下调。总之，长期暴露于热应激可能导致基因表达的改变，可能形成它们亚最佳的生长条件。

  2、 热应激下，二级结构较低级的基因被翻译

  热应激下，翻译上调的基因不易在起始密码子附近形成次生结构。

  A、热应激下，与所有的蛋白质编码基因相比，翻译上调（红线）和下调（蓝线）基因的平均折叠能量。只有在标记区域（放大部分），曲线表现出显著的差异。相同颜色的细线表示每个位置的标准偏差。位置0是每个基因起始密码子的第一个核苷酸。

  B、热应激下，与所有的蛋白质编码基因相比，翻译上调（红线）和下调（蓝线）基因的平均折叠能量的箱线图。统计的是上游100 nt开始到起始密码子（0位）的基因。下调基因的平均折叠能量和蛋白编码基因差别不大。

  C、热应激下，翻译上调基因的5′UTRs和3′UTRs的Motif序列分析。为了看看RNA结合蛋白是否有助于翻译调控。55个5′UTRs上调的基因中的23个有保守的A/G富集的motif。82个3′UTRs上调的基因中的23个也有保守的A/G富集的motif。

  3、 热应激后，UTR区存在的G2四联体可能与基因表达相关

  推测，如果G四联体与热应激有关，将会产生翻译的差异，如RPF覆盖率不同。发现热应激下表达上调的基因的RPF的覆盖率更高。

  A、C、热应激的植物（红）与对照植物（蓝色）在归一化的RPF reads相对于各位置的mRNA reads的较高的累积值，在5′UTRs（A）和3′UTRs（C）假定的G2四联体的位置。G2四联体的第一个核苷酸位置在200。

  B、有G2四联体的基因在5′非编码区的RPF表达变化分析。热应激下，表达上调的基因（RPF up）与有G2四联体的但表达不变或下调的基因（RPF 0/down）的比较。n表示各组的基因数。

  D、基因At3g56090在热应激和对照下，RPF的覆盖率。5′非编码区的G2四联体的位置如灰色阴影所示。黑色：CDS；灰色：5或3′UTRs；灰色虚线：内含子。

  E、3′非编码区的G2四联体，在前半部分和后半部分的reads比较。

  4、 热应激下，At1g76880基因的可变剪接异构体高表达

  A、At1g76880基因的ORF示意图。黑色：CDS区；灰色：5′或3′UTRs；灰色虚线：内含子；箭头：实时荧光定量PCR引物的位置。

  B、除了主要的转录本，一个编码88个氨基酸的长肽在核糖体分析（红色）和RNA-seq（灰色）中均检测到，且热应激下表达水平更高。虚垂直线表示ORF的起始位置。热应激下，荧光定量PCR验证（右图）生成的主要转录本和可变剪接异构体的表达量。

  C、MEME分析得到的三种不同的motifs存在于可变剪接异构体ORF起始位点上游的1 kb的区域内，和多个热应激反应基因。

  5、 热应激对叶绿体中蛋白质复合物表达的影响。

  A、蛋白质含量（RPF reads）和质谱法测定蛋白质丰度之间的联系。Spearman相关系数ρ= 0.746。

  B、蛋白质生产的ATP合成酶亚基与组装的亚基化学计量学相联系。属于两个操纵子的基因用蓝色和红色表示。

  C、两个操纵子的基因分布原理图。RNA-seq分析证实，这两个操纵子的mRNA水平类似，进一步验证了化学计量的差异可能会被控制在翻译水平。

  D、所有的叶绿体基因RPF和mRNA的差异倍数比较。每个点代表一个单一的蛋白质或蛋白质亚基。

  E、热应激不成比例地减少了ATP合成酶亚基的生产。（与B相比）

  亮点分析：

  1、一些可能由不同的二级结构元件调控翻译的基因可能会调整植物对热应激的适应。

  2、核糖体分析和RNA-seq的数据可能提供拟南芥在常温和对热应激适应的资源，未来的实验可以集中于理解调控细胞核和叶绿体的编码基因。

  参考文献：

  Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq.

  BMC Plant Biology. 2016, IF=3.631