揭示番茄冻害中circRNAs的作用

  摘要：

  在动物和植物中通过高通量测序新发现的各种环状RNAs（circRNAs）在miRNA的功能和转录控制中发挥重要作用。然而，很少有研究针对番茄果实的circRNAs。在这项研究中，我们在全基因组层面系统地分析了circRNAs，利用深度测序和生物信息学相结合的方法。共鉴定到854个circRNAs，确定了其中163个circRNAs响应低温。部分circRNAs预测参与冻害响应反应，如氧化还原反应、细胞壁降解、精氨酸和多胺代谢、冷和热休克蛋白、能量代谢、茉莉酸和脱落酸代谢、低温和盐胁迫响应蛋白、低温诱导转录因子（CBF和WRKY）。此外，102个circRNAs被发现作为对应的24个miRNA海绵，抑制miRNA。这些发现揭示了意想不到的复杂的circRNAs调控，有助于理解植物中circRNAs的功能。

  材料与方法：

  材料：番茄品种“Rui Xin”的成熟期。

  取材方法：对照组放在冷库10℃中72h，冻害组放在冷库0℃中72h。冻害致伤组显示点蚀症状。取果皮，液氮速冻，-80℃保存。

  测序策略和分析流程：

  测序：Illumina HiSeq2500，PE。提取2µg 总RNA，用Ribo-Zero rRNA Removal Kit进行去rRNA建库。插入片段的长度150 ~ 250bp。

  分析：比对到参考基因组：TopHat2 version 2.0.10；

  环状RNA鉴定及表达量：CIRI (CircRNA Identifier) tools；

  环状RNA靶miRNA预测：miRanda (anmial)，RNAhybrid (animal) and TargetFinder (plant) tools；

  差异表达分析：DESeq R package (1.10.1)；

  基因功能注释数据库：Nr (NCBI non-redundant protein sequences)；Pfam (Protein family)；KOG/COG (Clusters of Orthologous Groups of proteins)；Swiss-Prot (A manually annotated and reviewed protein sequence database)；KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)；GO (Gene Ontology)。

  GO富集分析：topGO R packages；

  结果：

  1、 番茄circRNAs的鉴定

  对照组有36.57M raw reads，冻害组有35.69M raw reads。分别发现3046（对照组）和3019（冻害组）个circRNAs，unique circRNAs分别有401（对照组）和770（冻害组）个。

  在所有鉴定的circRNAs中，615（72%）来自于外显子区，208（24.4%）来自于基因间区，31（3.6%）来自于内含子区。

  不同的染色体产生不同数目的circRNAs，1号染色体最多。

  2、 番茄circRNAs的表达模式

  circRNAs的特异性表达对其生物学功能提供线索。为了检查circRNAs是否以特定的方式在冷冻损伤中表达，我们分析了两组间的circRNAs表达。大多数表现出不同的特异性表达模式。在854个circRNAs中，163个circRNAs在对照组和冻害组之间存在显著性差异，138个circRNAs上调，25个circRNAs下调，这表明它们在冻害调控中的特异性作用。

  3、 靶基因预测及与番茄冻害相关的circRNAs的分析

  为了解circRNA的功能，预测并仔细分析了circRNA的靶基因，进行了GO分析、KEGG途径分析和蛋白质直系同源群分析。对miRNA的GO分析表明，靶miRNAs与涉及不同生物过程、分子功能和细胞组分的各种功能相关。

  仔细筛选circRNA的所有预测的靶基因，涉及冷冻损伤的circRNA的862个靶基因被鉴定为涉及与细胞壁有关的氧化还原反应相关酶，膜脂质过氧化相关酶，精氨酸和多胺代谢，热和冷休克蛋白，氧化还原反应中的能量代谢相关酶，茉莉酸和脱落酸代谢中，低温和盐反应蛋白家族。出乎意料地，也检测到几种低温诱导的转录因子基因，例如编码CBF和WRKY的基因。

  4、 作用miRNA海绵的circRNAs的鉴定

  据报道，circRNA在miRNA功能和转录调控中发挥重要作用，通过作为竞争内源性RNAs或其亲本编码基因的正调节子。为了检测番茄circRNAs是否可以通过结合到miRNAs并阻止它们调节它们的靶mRNA而影响基因转录后调控，使用生物信息学方法，发现24种miRNA和其对应的102种circRNA（表1）。在miRNA中，预测到几种靶基因参与冷却损伤过程，例如氧化还原反应过程、细胞壁降解过程、热和冷休克蛋白、低温诱导的转录因子和能量代谢过程。因此，circRNAs可能作为miRNA海绵，在冷冻伤害调节中发挥重要作用。

  亮点分析：

  1、在番茄果实的全基因组中鉴定circRNAs。

  2、circRNAs预测参与冻害响应反应。

  3、circRNAs被发现作为miRNA海绵，抑制miRNA的表达。

  参考文献：

  Deciphering the roles of circRNAs on chilling injury in tomato.

  Biochemical and Biophysical Research Communications. 2016, IF=2.371