水稻中circRNA的全转录组研究

  circRNA作为一种非编码RNA，在动物特别是人中的研究比较多，但在植物中的研究非常有限。植物中的circRNA是否和动物具有相同的特质、发挥相似的调控作用？文章以水稻Oryza sativa为研究目标，进行了全基因组范围circRNA的鉴别，并对其特性进行了分析。

  摘要：  

  在古细菌、秀丽隐杆线虫、小鼠和人类中，高通量测序结合转录组数据分析，将各种稳定的环状RNA（circRNA）鉴定为非编码RNA。CircRNAs，作为竞争性内源RNA（ceRNA）或其亲本编码基因的正调节子，在调控miRNA功能和转录中起重要作用。然而，植物中的circRNAs知之甚少。本文通过深度测序和ssRNA -seq（链特异性RNA测序）数据的计算分析，报道了2354个circRNAs，在水稻中普遍存在。其中1356个是外显子circRNAs。一些circRNAs组织特异性表达。水稻circRNA有大量的异构体，包括反向剪接和可变剪接环化。具有多个外显子的亲本基因优先被环化。只有484个circRNAs在已知剪接位点发生反向剪切。只有92个circRNA在侧翼序列中富集了微型反向重复转座元件（MITE），或与至少18-bp的侧翼区的内含子序列互补，表明水稻中除了反向剪接还有其他产生circRNA的机理。水稻circRNA没有显着富集miRNA靶位点。转基因研究表明，与空载体对照植物相比，circRNA过表达的构建体可以降低转基因植物中亲本基因的表达水平。表明circRNA及其线性形式可能作为亲本基因的负调节器。

  植物材料：  

  栽培水稻粳稻日本晴的种子，30℃下在培养箱中发芽。在开花时收获穗和成熟叶，提取RNA。 

  基因组DNA、总RNA提取和RNase R处理：  

  从新鲜组织中提取基因组DNA。基因组DNA用作反向引物的阴性对照。 

  用TRIzol试剂盒提取总RNA。为了除去多糖污染，将0.25mL异丙醇加入到水相中，然后每1mL TRIzol试剂加入0.25mL高盐沉淀溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl）以沉淀RNA。用DNase I（NEB）处理总RNA样品，并通过RNA Clean＆Concentrator-25离心柱（ZYMO Research）纯化以除去DNA污染物和盐。使用2.0％TAE-琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

  对于需用RNase R处理的总RNA样品，DNase I纯化处理的总RNA在37℃下与3单位μg-1的RNase R（Epicentre）孵育15分钟。随后通过苯酚-氯仿提取纯化RNA，并在三倍体积的乙醇中再沉淀。

  PCR扩增和Sanger测序：  

  设计PCR引物（反向和正向）用于circRNA验证。将DNA酶I和RNA酶R处理的总RNA逆转录的cDNA和基因组DNA用作模板。将正向引物用作线性转录本的阳性对照，反向引物用来检测候选的环状转录本。每次PCR扩增用20ng cDNA或基因组DNA与rTaq DNA聚合酶和10×缓冲液（Takara）。从凝胶上分离预期长度的PCR产物，使用PCR纯化QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen），在ABI 3730测序仪上对PCR结果直接测序。

  半定量和定量实时PCR：  

  使用SSIII逆转录酶（Invitrogen）用随机引物对RNase R处理的总RNA样品和未处理的RNA样品进行逆转录。对于qRT-PCR，使用SYBR Green PCR MasterMix（Takara）扩增一链cDNA。在Applied Biosystems 7500实时PCR系统上进行qRT-PCR。每组实验重复三次。

  ssRNA-seq（链特异性）文库制备和Illumina测序：  

  用RiboMinus Plant Kit（Invitrogen）去除核糖体RNA。用Dynabeads mRNA纯化试剂盒（Ambion）从去除rRNA的RNA样品中纯化poly（A）+ mRNA。缺少poly（A）尾的RNA不会杂交，易被洗去。其余部分进一步制备为poly（A）- mRNA样品。然后用RNA片段化试剂盒（Ambion）将RNA片段化，制备cDNA文库。HiSeq 2000，分别以2pM的浓度进行2×100bp的双端测序。

  全长cDNA文库制备和PacBio RS II测序：  

  SMARTer PCR cDNA合成试剂盒（Clontech）用于产生全长cDNA。根据SMRTbell模板protocol（SMRTbell模板制备试剂盒1.0），每个文库最少加入1μg dsDNA。在外切核酸酶消化不完全的SMRTbell模板后，用0.45×AMPure PB纯化（Pacific Biosciences）连续两次纯化文库。在Pacific Biosciences RS II上对不同大小文库的三个SMRT cells测序。

  Reads比对及分析：  

  使用软件SeqtrimNext对从叶和穗两者获得的所有ssRNA-seq数据进行预处理。用SMALT v0.5.7进行序列比对，分别比对到RAP-DB基因组注释数据和水稻参考基因组IRGSPv5.0。根据软件TopHat v1.3.3、Cufflinks v2.0.2和samtools v0.1.15的比对结果，显示转录本的覆盖情况。参考注释基因模型，计算每个转录本的FPKM。用Pearson's χ2检验评估生物学重复。用Cufflinks v2.0.2软件的“cuffdiff”鉴定差异表达基因（DEG）。用Web Gene Ontology Annotation Plot（WEGO）服务器，将基因进行GO富集，分类为不同的功能过程。

  预测水稻circRNAs中作为miRNA目标模拟物：  

  从miRBase下载713个水稻miRNA前体和成熟miRNA的序列。将1356个circRNAs用作miRNA目标模拟物预测。用Perl脚本使用以下规则预测目标模拟物：（i）在miRNA的5'和第九至第十二位置必须存在3-bp突起;（ii）除了中央凸起外，不存在其他凸起;（iii）在5'端，miRNA的第二至第八位置必须与circRNA的互补位点完全配对;（iv）除中央凸起区域外，在miRNA和circRNA对内至多允许三个错配。

  结果：

  1、 水稻中circRNA的鉴定  

  测序共产生710M PE reads。  

  研究水稻中稳定表达的circRNAs，重点针对circRNAs的反向剪接。  

  首先，提取唯一且有部分比对到基因组的reads。然后收集两个末端区域（20bp）可以唯一锚定到相同的染色体序列的reads。其次，对于每个候选，根据其锚定位置，下游和上游序列被反向装配成伪基因组。可以将cDNA序列比对至基因组，搜索反向剪接。此外，参考reads的基因组位置，滤出比对到后剪接外显子之外的序列，其不能由circRNA解释。最后，我们要求每个backsplice至少由两个独立的junction-spanning reads支持，且反向剪接连接点侧接GU / AG内含子信号。  

  从水稻中的poly（A）+和poly（A）-ssRNA-seq数据中鉴定了2354个唯一比对的circRNAs。  

  （A）circRNA的鉴定流程图。GMAP是基因组作图和比对程序。 

  （B）估计灵敏度和错误发现率。五个独立数据集的灵敏度> 81.4％，FDR<1.7％。  

  （C）水稻叶和穗的poly（A）+ mRNA和poly（A）- mRNA样品中检测到的circRNA的维恩图。  

  （D）水稻circRNA的基因组来源。红色数字代表全部的2354个circRNA的基因组注释。绿色数字表示可以以反义方式比对上其他基因的circRNA。

  2、 各种实验策略验证水稻circRNAs。 

  （A）水稻环状RNA（以Os09circ11453为例）的验证策略。设计反向和正向引物以检测环状RNA。Sanger测序进一步证实了头对尾的反向剪接。 

  （B）反向引物在cDNA中成功扩增了三个circRNA（Os01circ14411，Os07circ08968和Os03circ20866），但在基因组DNA中没有扩增。正向引物在cDNA和基因组DNA中都有扩增。OsActin1是线性对照组。 

  （C）qRT-PCR显示8个circRNA在RNase R（-）和RNase R（+）的总RNA样品中都稳定表达，而线性对照在RNase R（+）样品中不表达。 

  （D）RT-PCR进一步显示11个circRNA是RNase R抗性的。一些circRNA显示组织特异性表达。（I）在两种组织中高表达的cycRNA; （II）circRNA仅在叶中高表达; （III）circRNA仅在穗中高表达; （IV）在叶中特异表达的circRNA;和（V）在穗中特异表达的circRNA。  

  （E）根据ssRNA-seq数据和RT-PCR总结的30个circRNA在叶和穗聚（A）-和聚（A）+样品中的表达结果。（a）从叶聚（A）+ ssRNA-seq获得的结果；（b）从叶聚（A）+ RT-PCR获得的结果；（c）从穗聚（A）+ ssRNA-seq获得的结果；（d）从穗聚（A）+ RT-PCR获得的结果；（e）从叶聚（A）-ssRNA-seq获得的结果；（f）从叶聚（A）-RT-PCR获得的结果；（g）从穗聚（A）-ssRNA-seq获得的结果；（h）从穗聚（A）-RT-PCR获得的结果。

  3、 水稻三个可变剪接环化事件的可视化和验证。  

  （A）叶（指示两条带）和穗（指示六条带）中的circRNA“Os10circ03574”用反向引物进行PCR扩增。通过Sanger测序进一步证实了反向剪接位点。使用原始文件将序列可视化。红色倒三角形表示连接位点。右侧详细显示了从Sanger测序获得的“Os10circ03574”的七个可变剪接环化结构。棕色条表示外显子，灰色条表示UTR，棕色线表示内含子。  

  （B，C）与A类似，显示PCR扩增和Sanger测序的结果。鉴定和验证了可变反向剪接环化事件。

  4、分析转基因水稻植物中circRNA“Os08circ16564”的过表达。  

  （A）Os08circ16564的环化结构及其亲本基因（AK064900）的可视化。棕色条表示外显子，灰色条表示UTR，棕色线表示内含子。垂直三角形表示预测的miRNA osa-miR810b.2（红色）和osa-miR172d-5p（绿色）结合位点。  

  （B）Os08circ16564过表达转基因株系和空载体转基因株系的qRT-PCR结果。从三个独立的株系收集叶和穗。（E.C.-con）用于空载体转基因植物的正向PCR；（O.E.-con）用于过表达转基因植物的正向PCR；（E.C.-div）用于空载体转基因植物的反向PCR；（O.E.-div）用于过表达转基因植物的反向PCR。右图是Os08circ16564过表达转基因植物中的反向引物qRT-PCR结果。肌动蛋白用作线性对照。从五个独立的水稻植物收集叶和穗。  

  （C）qRT-PCR结果显示，与空载体转基因植物相比，Os08circ16564过表达转基因植物的叶和穗组织中Os08circ16564亲本基因AK064900的表达水平大大降低。从10个系中收集叶和穗组织。  

  （D）叶和穗中过表达转基因系和空载体转基因系之间的DEG的功能分类。

  亮点分析：  

  1、首次对植物中的circRNA进行全基因组鉴定和功能分析，表明circRNA在稻中是普遍的并稳定表达的。  

  2、推测circRNAs及其线性形式可能充当亲本基因的负调节剂。