裸鼹鼠（Heterocephalus glaber）的抗癌特性与lncRNA密切相关

  前言：  

  裸鼹鼠（Heterocephalus glaber）是啮齿类动物中名副其实的长寿之星，其寿命可长达30年，而一般小鼠及大鼠的寿命仅有2~3年。此外，裸鼹鼠还具有天然的抗癌特性，因此裸鼹鼠在长寿和肿瘤研究领域受到极其广泛的关注。长链非编码RNA（LncRNA）被定义为长度大于200bp而不具备编码蛋白潜能的转录本，过去认为lncRNA只是基因组中的“junk DNA”，如今发现lncRNA不仅能精确调控发育和基因表达，更是与诸多老年疾病（如老年痴呆、肿瘤等）的发生息息相关。二代测序技术以及生物信息学的快速发展使得我们可以快速、准确地挖掘不同物种的lncRNA序列，并对其功能进行有效的预测。

  摘要：  

  背景：长非编码RNA（lncRNA）是一类普遍存在的非编码RNA，已经被发现用作肿瘤抑制基因或致癌基因。裸鼹鼠（NMR，Heterocephalus glaber）是一种异常长寿和抗癌的啮齿动物。然而，lncRNAs是否在其抗癌中发挥作用仍然未知。  

  结果：这项研究开发了一个流程，并基于12个发表的转录组数据鉴定了共4422个lncRNAs。系统分析表明，NMR的lncRNAs与其他脊椎动物物种有许多共同的特征，如组织特异性和低表达量。与1057个人类癌症相关的lncRNAs的BLASTN结果显示，只有5个NMR lncRNA与之有同源性，表明NMR的lncRNA和人类癌症相关的lncRNA之间的序列保守性较低。NMR的lncRNAs和蛋白质编码基因的关联分析显示，共1295个lncRNAs与潜在的肿瘤抑制基因密切相关（r≥0.9或r≤-0.9，cP值≤0.01），194个lncRNAs与四个高分子量透明质酸相关基因较强相关（r≥0.8或r≤-0.8，cP值≤0.01），这四个基因先前被鉴定在NMR的抗癌特性中起关键作用。  

  结论：首次对NMR的lncRNAs及其与癌症抗性的可能关联进行全基因组综合分析。研究结果表明lncRNAs可能对NMR的抗癌机制有重要影响。 

  关键词：裸鼹鼠，长非编码RNA，表达谱，共表达，癌症抗性

  数据下载  

  裸鼹鼠和大鼠（rat）的原始转录组数据在国家生物技术信息中心数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）获得。  

  从GIGA数据库（http://gigadb.org/dataset/100022）下载组装好的NMR基因组序列和注释文件。从GENCODE数据库（http://www.gencodegenes.org/）下载人和小鼠（mouse）的LncRNA序列。从NONCODE数据库下载大鼠（rat）的LncRNA序列。

  LncRNA鉴定流程  

  为了全面鉴定NMR的lncRNAs，收集了来自新生儿、4岁、4岁低氧处理、20岁的NMR的三种组织（肾，肝和脑）的12个转录组。 

  使用依次过滤的流程来鉴定12个RNA-seq数据集中假定的lncRNA。  

  （1）使用SolexaQA过滤低质量的（Phred得分<20）和短的（长度<30bp）的reads。然后使用Tophat将过滤后的reads比对到NMR的基因组。 

  （2）通过Cufflinks和Cuffmerge组装并合并reads，然后利用Cuffcompare获得每个样本的非编码转录物。短于200bp的转录物被排除。  

  （3）使用编码潜力计算（CPC）来评估转录物的蛋白质编码潜力，并去除CPC≥-1的转录物。  

  （4）为了评估剩余的转录物是否包含已知的蛋白质编码结构域，将转录物BLAST至Pfam数据库和非冗余蛋白质数据库（NR），排除比对上的转录物。  

  （5）去除FPKM值低于0.3的转录物。

  OrthoMCL，BLAST和位置保守性分析  

  根据以前报道的方法，采用OrthoMCL流程，用BLASN程序比较NMR、小鼠和人的lncRNAs的序列相似性。保留覆盖度≥50％和、E值≤1E-5的BLASTN结果，使用马尔可夫簇（MCL）算法分配假定的直系同源群。在NMR的lncRNA和人癌症相关的lncRNA之间进行BLASTN同源性检索。保留覆盖度> 40％、E值<1e-5的LncRNA。进行位置保守性分析时，首先从BLAST结果中检索E值≤1E-5的lncRNAs对，并将其作为假定的同源序列。然后用MCScanX和默认参数在NMR、小鼠和人之间构建了共线性区。当研究裸鼹鼠和人之间的两个直系同源蛋白编码基因G1和G2时，在NMR的G1的815kb内和人的G2的894kb内检测到lncRNAs。当lncRNA重叠或结束于5'端，认为其在蛋白质编码基因的“上游”；当其重叠或开始于3'端，认为其在蛋白质编码基因的“下游”。如果来自NMR和人的两个lncRNA——L1和L2都在G1和G2的上游或下游，则它们被认为是共线性的。

  共表达分析  

  为了研究lncRNA和癌症抗性之间的可能相关性，通过分别测试其12个转录组的FPKM值，在NMR和大鼠中进行共表达分析。Tophat和cufflinks用于获得lncRNAs和mRNAs的FPKM值。至少在四个发育组织中表达的PCG保留用于5个NMR-HCRL的共表达分析。在所有组织中表达的lncRNAs和候选肿瘤抑制基因、lncRNAs和mRNAs保留用于NMR和大鼠的共表达分析。在本研究中，利用Pearson相关系数（r）和相关P值（cP值）通过内部matlab脚本评估共表达关系。r≥0.8或r≤-0.8，cP值≤0.01被认为是较强相关，而r≥0.9或r≤-0.9，cP值≤0.01被认为是密切相关。

  功能富集分析  

  将与5个NMR-HCRLs相关的蛋白质编码基因分类，使用超几何分布和Bonferroni校正对多个假设检验进行GO和KEGG通路富集分析，其中cutoff的P值为0.01。

  结果：

  1、 全基因组鉴定NMR的lncRNAs及其特征  

  用于鉴定裸鼹鼠中的lncRNAs的流程。  

  a、数据预处理和转录组组装。b、LncRNA鉴定和分类。

  在裸鼹鼠中鉴定到的高质量的lncRNAs。 

  共有4422个潜在的lncRNA，由3684个长基因间区非编码RNA（lincRNA），733个反义lncRNA（anti-lncRNA）和5个内含子区域转录的lncRNA（in-lncRNA）组成。

  裸鼹鼠中lncRNAs和蛋白编码基因（PCGs）之间的比较。 

  a、序列长度。b、外显子数。c、GC含量。d、表达水平。

  NMR的lncRNAs的平均长度为16,625 bp，其中in-lncRNAs（3922 bp）的长度显着短于antilncRNA（19,668 bp）和lincRNA（16,037 bp）。与蛋白质编码基因（PCG）相比，lncRNAs长度较短（图2a），每个lncRNA转录物的平均外显子数较少（2.51比8.05，图2b），但GC含量较高（图2c）。lncRNAs的表达水平也比PCGs更低（图2d），这一现象也在其他物种（如虹鳟、太平洋牡蛎）中观察到。总之，与PCG相比，NMR中的lncRNA具有更高的GC含量，但更短的长度、更少的外显子数和更低的表达水平。

  2、 NMR 中lncRNAs的表达谱  

  在不同年龄和不同组织中裸鼹鼠lncRNAs的分布。 

  超过80％的lncRNAs在所有年龄的NMR中均表达。分别在新生儿、4岁和20岁的NMR中特异性表达的有45个lncRNA、29个lncRNA和31个lncRNA。 lncRNA的年龄特异性表达表明一些lncRNA可能在NMR的生长和发育中起作用。此外，67个lncRNAs在4岁低氧处理的NMR中特异性表达，表明它们可能参与低氧代谢。 

  使用来自NMR的肝，肾和脑的RNA-seq数据集研究lncRNA的组织特异性表达。与其他脊椎动物物种一致，NMR的lncRNAs也是显着的组织特异性表达模式。3667个 lncRNAs至少在一种组织类型中表达，190个在脑中特异性表达，226个在肾脏中特异性地表达，205个在肝脏中特异性表达。

  3、 跨发育组织的lncRNAs的差异表达

  热图显示40个lncRNAs在裸鼹鼠的脑、肾和肝组织中的差异表达。  

  研究表明，一些ncRNA的转录可以调节其邻近PCG的能力，有正向调节和反向调节。因此，选择了13个在肝脏或脑中表达显着不同的lncRNAs，发现它们邻近的PCG也表现出代谢相关或脑相关功能，表明一些lncRNA可能与它们的相邻PCG有功能连接。

  4、NMR、人和小鼠lncRNA的保守性分析  

  人（HUM），小鼠（MUS）和裸鼹鼠（NMR）中的LncRNA保守性分析。  

  a、序列保守。b、位置保守。

  为了鉴定人和小鼠中的NMR lncRNA的同源物，从GENCODE数据库下载两个物种的lncRNA序列。使用OrthoMCL的BLASTN程序进行三个物种的lncRNA的直系同源分析，NMR中超过4359个（98％）lncRNA在人和小鼠lncRNA中没有同源物。在三个物种中仅有11个直系同源物，表明lncRNA的序列保守性较低。  

  LncRNA在不同生物体中的基因组位置比序列具有更高的保守性。对三种物种之间的lncRNA位置保守性进行了分析。NMR中分别有35个和41个lncRNAs显示对人和小鼠的保守性。

  5、NMR的lncRNA和人类癌症相关的lncRNA的同源性分析

  NMR对自发性癌症和实验性诱导的肿瘤发生有抗性。为了研究NMR的lncRNA和癌症相关的lncRNA之间的序列保守性，进行同源分析。从Lnc2Cancer数据库中下载了1057个lncRNA（实验证明与86种人类癌症相关），然后用NMR lncRNA进行BLASTN同源性搜索。  

  NMR的5个lncRNAs与人类癌症相关的lncRNA的有同源性。表明NMR lncRNA和人癌症相关的lncRNA之间的序列保守性较低。用BLASTN在NONCODE数据库检索NMR中与人类癌症相关的5个lncRNAs（NMR-HCRLs），在小鼠、大鼠中也发现高度相似的序列，表明它们可能在物种间保守。 裸鼹鼠（Heterocephalus glaber）的抗癌特性与lncRNA密切相关

  6、NMR的lncRNAs与四个HMM-HA相关基因的共表达分析

  HMM-HA（高分子量透明质酸）可以介导NMR的抗癌性。在NMR细胞中透明质酸合酶2（HAS2）的沉默或HA降解酶（HYAL2）的过表达会导致NMR易发生肿瘤。因此，选择了四个HMM-HA相关基因（CD44，NF2，HYAL2和HAS2），与NMR所有发育组织中表达的lncRNA进行共表达分析。结果显示lncRNA2464、77、471与HYAL2正表达，与NF2负表达。lncRNA 691、852、2980与NF2正表达，与HYAL2负表达。在NMR中，lncRNA和HA相关基因的不同共表达模式可能有助于HA合成或肿瘤发生，lncRNA可能参与HMM-HA调节。

  亮点分析：  

  1、以裸鼹鼠为研究对象，建立了一套严格的lncRNA鉴定流程，从裸鼹鼠基因组中成功鉴定出4,422条高质量lncRNA，并发现裸鼹鼠的lncRNA具有表达丰度低、组织特异性强及保守性低等特点。  

  2、通过共表达分析对裸鼹鼠的lncRNA功能进行预测，发现大约61.93%的裸鼹鼠lncRNA与抑癌基因表达高度相关。裸鼹鼠的lncRNA与透明质酸相关基因存在较高的共表达关系，而透明质酸已被证实是裸鼹鼠具备抗癌特性的关键物质。该结果提示，裸鼹鼠的lncRNA可能通过调控透明质酸的生成，使得其拥有天然的抗癌特性。

  参考文献：  

  Insights into long noncoding RNAs of naked mole rat (Heterocephalus glaber) and their potential association with cancer resistance.  

  Epigenetics & Chromatin. 2016