显微切割组织的比较蛋白质组学揭示了膀胱癌的新生物标志物

  摘要  

  在全世界每年有超过38万患者被诊断为膀胱癌新病例，其中死亡人数150,200。为了发现膀胱癌的潜在生物标志物，我们采用了激光显微切割技术，iTRAQ标记以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析相结合来研究新鲜冷冻膀胱肿瘤样本。从四对手术切除的原发性膀胱癌肿瘤和相邻的非肿瘤组织提取蛋白，用于两次iTRAQ实验，确定了总共3220个蛋白质。采用DAVID（用于注释，可视化和综合发现的数据库）数据库分析差异表达的蛋白质，揭示了排名最靠前的三个生物过程是细胞外基质组织，细胞外结构组织和氧化还原。膀胱癌中包括有机物的响应，金属离子的响应和无机物响应的生物过程对应的蛋白质表达量上调。筛选出七种差异表达的蛋白作为潜在的膀胱癌生物标志物，用于进一步验证。免疫组织化学分析显示，与非癌性膀胱上皮细胞相比，肿瘤细胞中三种蛋白质SLC3A2，STMN1和TAGLN2的水平显着升高，并且预测TAGLN2可能是用于诊断的有效的肿瘤组织标志物，可以用于评估膀胱癌患者淋巴结转移情况（AUC=0.999）。ELISA结果显示，与对照组相比，膀胱癌组中STMN1和TAGLN2水平显着增加。与标记的疝尿液样本相比，膀胱癌样品中的TAGLN2显示出最大的差异倍数（7.13倍），曲线下面积值为0.70（p<0.001，n=205）。总体而言，TAGLN2在个体膀胱癌组织和尿液样本中显示出最显着的过表达，因此可以作为膀胱癌的无创筛查的潜在生物标志物。研究结果强调了膀胱组织蛋白质组学研究的意义，并为尿路上皮癌中的潜在生物标志物的进一步验证提供有价值的信息。

  材料方法

  临床标本  

  LCM和用于LC-MS / MS分析的蛋白质提取 

  从四名患者（两名女性和两名男性）获得手术切除的原发性膀胱肿瘤和相邻非肿瘤组织的新鲜冷冻标本。  

  iTRAQ标记肽的分级分离  

  通过LTQ-Orbitrap –Q裂解的LC-ESI MS / MS分析  

  Liquid chromatography-electrospray ionization (LC-ESI) MS/MS 偶联LTQ-Orbitrap  

  MS数据处理，数据库搜索和蛋白质定量  

  使用默认设置的TPP软件（版本4.0）验证蛋白质鉴定和定量，去除冗余作为最终获得的蛋白质报告。 使用MASCOT搜索每个LC MS /MS运行生成DAT文件。  

  免疫组织化学染色  

  用于尿蛋白定量的ELISA实验  

  ELISA试剂盒，加入相应抗体和牛血清白蛋白温育后，用SpectraMax M5酶标仪分别使用355和460nm的激发和发射波长测量荧光。  

  使用DAVID生物信息学资源鉴定差异表达蛋白质的相关途径 

  使用可访问的DAVID 6.7程序（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）的工具进行差异表达的蛋白质的网络分析

  统计学分析

  SPSS 软件

  结果

  在两次iTRAQ实验中的四个个体组织样品中的蛋白质的鉴定和定量  

  在生物标志物发现阶段，获得来自手术切除的原发性膀胱癌的癌性和相邻非肿瘤组织的四对样品的细胞，用于两批iTRAQ实验（图1C）。图1A显示了用于LCM的肿瘤和非肿瘤切片的代表性图像。通过SDS-PAGE检测从四对显微切割样品提取的蛋白质，然后进行银染色（图1B）。

  图1 .A来自四个膀胱癌患者的膀胱肿瘤组织（T）和相邻非肿瘤组织（N）的尿路上皮细胞的LCM(激光捕获显微切割)解剖图。将组织冷冻切片固定并用苏木红（HE）染色用于病理分析。将组织样品用苏木精染色用于LCM实验。用于蛋白质提取的区域用红色圆圈和箭头标记。B，从显微切割细胞提取的蛋白质的SDS-PAGE分析。C，两次iTRAQ实验用于分析来自四名膀胱癌患者显微切割的膀胱肿瘤和相邻非肿瘤组织。使用115/114（T1/N1和T3/N3）和117/116（T2/N2和T4/N4）报告离子的峰面积比表示肿瘤和相邻正常细胞之间的表达差异。

  使用由iTRAQ报告子离子确定的相同患者的肿瘤和非肿瘤细胞中蛋白质表达的峰面积比（T / N比）来选择候选生物标志物。 iTRAQ实验1和2分别鉴定了2325和2477个蛋白质。在两个临床样品组中鉴定的蛋白质的整合产生总共3217个独特的膀胱组织蛋白质。其中在两个实验中鉴定到的共同蛋白质有1585个（49.3％）。两个临床样品组的蛋白质/肽鉴定和定量详情显示在图2中。

  图2 在两次iTRAQ实验中使用四对显微切割膀胱肿瘤样本中蛋白质的鉴定和定量。

  在临床样品组1和2中分别定量了1866个蛋白质和2067个蛋白质的iTRAQ比值; 在两个样品组中共同定量的蛋白质为1248个（46.5％）。 在总共2685个定量蛋白质中，基于至少一种LIBRA肽在肿瘤组与其相邻正常组之间倍数差异显示为1.50或0.67的蛋白质分别定义为蛋白质增加或减少。 这些定量蛋白质分为以下四类：（1）膀胱癌非肿瘤：131种; （2）膀胱癌非肿瘤：181种; （3）膀胱癌与非肿瘤之间无显着差异：227种;（4）其他：2146种。 每个亚组中定量蛋白质的定义和数量总结在表1中。

  表1 在两次iTRAQ实验中四个患者的膀胱肿瘤蛋白质组中蛋白质鉴定和定量的概述

  组织标本中生物标志物表达的诊断/预后价值的验证

  基于iTRAQ结果和与人类癌症的相关性，我们选择七个候选生物标志物-CA2，PGK1，SFN，SLC3A2，STMN1，TAGLN2和TXN（在四对的显微切割组织标本中至少有三个过表达），用于进一步IHC验证。 由病理学家对肿瘤组织切片的染色强度和阳性细胞的百分比进行评分; 肿瘤细胞中三种候选物（SLC3A2，STMN1和TAGLN2）的IHC评分显着高于非癌性膀胱上皮细胞（p< 0.001，n =119-195;表2，图3）。

  表2 详细的生物标志物数据和七个候选蛋白质在组织和尿样本中的验证  

  IHC平均得分的相应差异倍数对于SLC3A2（AUC=0.937）为3.9，STMN1为1.9（AUC=0.876），TAGLN2为29.8（AUC=0.999）。由于膀胱肿瘤组织的固有特性，在石蜡包埋组织的各个切片中仅发现了10-20％的相邻非癌上皮细胞。在肿瘤组织细胞和非癌性细胞（p = 0.001，图3C）之间显示出最大IHC得分倍数增加的TAGLN2染色阳性细胞百分比在肿瘤细胞样品中为100％（121/121），在相邻的非癌细胞相同切片中为25%（3/12）。在95％（58/61）的正常膀胱组织样本中，TAGLN2染色强度不可检测或很弱， IHC得分小于5（n=61）。相比之下，86.8％（105/121）的阳性肿瘤样本中IHC结果显示TAGLN2染色强度为中度到强度。在相同的石蜡切片中，IHC评分显示第二高度差异的SLC3A2在肿瘤细胞和相邻非癌细胞中阳性染色百分比分别为99.2％（120/121）和38.5％（5/13）。 SLC3A2在阳性染色非癌性细胞的所有五个样本中染色强度均很弱，而73.3％（88/121）的阳性染色肿瘤样本显示SLC3A2染色强度为中度到强度。另外61个石蜡包埋的正常膀胱组织切片进一步证实了与肿瘤细胞相比较低的IHC得分（图3A）。一对组织切片的代表性染色模式和三个潜在标记蛋白的IHC评分结果显示在图3A-3C中。

  图3 通过IHC测定的个体膀胱肿瘤组织样品中A，SLC3A2; B，STMN1; C，TAGLN2的上调。

  使用卡方检验来评估SLC3A2，STMN1或TAGLN2蛋白的过表达与膀胱癌患者肿瘤样本的临床病理特征之间的关联。所有三种蛋白质显示与肿瘤等级显着相关，在较高级别的肿瘤切片中观察到较高的IHC评分（p = 0.004-0.015）。大肿瘤（>2cm）中STMN1的IHC评分高于小肿瘤。SLC3A2和TAGLN2的IHC得分在晚期TNM阶段较高。来自淋巴结转移患者的样本显示TAGLN2的IHC评分高于没有转移的患者（p = 0.008），表明TAGLN2可能是评估膀胱癌淋巴结转移的有效分子肿瘤标志物。具有临床病理特征的相关性Chi回归分析的详细统计结果显示在表3中。

  表3 与组织样本临床病理特征相关的SLC3A2，STMN1和TAGLN2蛋白的表达（IHC评分）

  尿液中生物标记物的诊断性能的验证

  我们通过Western印迹或ELISA获取膀胱癌和非恶性泌尿系统疾病患者（疝气）中的7个选定候选物的浓度，然后评估它们与疾病严重的相关性。在我们用于验证的Western印迹和ELISA条件下， SFN和SLC3A2蛋白质在尿中未检测到。通过蛋白质印迹法定量尿蛋白浓度，结果显示与来自疝气组的样品相比，膀胱癌组样品中CA2和PGK1的平均浓度分别增加1.4-3.3倍和2.1-4.5倍。通过ELISA测定法定量尿液中STMN1和TAGLN2的浓度。ELISA结果显示，与疝气患者的尿液样品（n = 152; p = 0.001）相比，在三个膀胱癌组中STMN1显示出1.8-3.2倍的增加，AUC值为0.67。在所有三个膀胱癌组中，尿液中TAGLN2浓度显着升高，与疝气患者尿液水平相比，显示出3.25至16.87倍的增加（总n = 205，p = 0.001）（图4）。在用于验证的候选标志物中， TAGLN2在所有膀胱癌患者中显示出最大的倍数变化（7.13倍），AUC值为0.70，使用333.0ng / ml作为截止值（p=0.001;图4）。CA2，PGK1，STMN1和TAGLN2这四种蛋白质在早期和晚期膀胱癌尿样本中表现出显着的浓度差异，因此可以作为阶段鉴别标志物。 CA2，PGK1和TAGLN2能够区分低度和高度癌症。与疝气患者相比，所有膀胱癌患者尿中的PGK1，STMN1和TAGLN2浓度显着升高（表2）。膀胱组织中TAGLN2和STMN1表达上调是膀胱癌尿液中TAGLN2和STMN1浓度提高的原因之一。

  图4 使用ELISA对205个患者的原尿样本中的TAGLN2蛋白进行定量。

  每个箱线图上方代表绝对定量值。 每个框线图中的水平线表示数据分布的第10，第25，第50，第75和第90百分位数。 使用ROC曲线来分析TAGLN2区分不同临床组的能力。 尿液TAGLN2蛋白能够区分膀胱癌与疝气，低度与高度膀胱癌以及早期阶段和晚期膀胱癌，p值为0.001。 根据TNM分期系统鉴定低度早期（LgEs），高度早期（HgEs）和高度晚期（HgAs）的样本状态。

  亮点 

  1. 结合LCM与iTRAQ技术，从癌症和相邻的正常细胞获得准确的定量蛋白质组数据，增加已知的膀胱肿瘤蛋白质组（增加到3217种蛋白质）和鉴定的候选生物标志物。 

  2. 采取了多种验证技术（ELISA、WB、IHC）相结合对候选蛋白进行验证，并且同时对组织和尿液都进行了验证，结果可靠。

  参考文献 

  Comparative Tissue Proteomics of Microdissected Specimens Reveals Novel Candidate Biomarkers of Bladder Cancer 

  Molecular & Cellular Proteomics (2015) IF=5.912