斑马鱼和猪早期胚胎发育期间有丰富的DNA 6mA甲基化

  摘要：

  DNA N6-甲基脱氧腺苷（6mA）主要是原核（细菌）DNA修饰，（以往的研究表明5mC修饰在调控哺乳动物基因表达中起着非常重要的作用；而6mA修饰广泛存在于细菌中，在DNA复制、修复、基因表达调控及宿主-病原体相互拮抗等方面发挥重要的功能。6mA修饰方式在高等真核生物基因组中由于其含量极低，因此其研究一直被忽视。）目前已经发现其在真核DNA中存在并发挥表观遗传的作用。本文研究表明，在脊椎动物的早期胚胎发育期间，6mA累积到总脱氧腺苷的0.1-0.2％，但随着胚胎发育，逐渐减少。在此过程中，大部分的6mAs位于基因组的重复区域。

  方法： 

  收集斑马鱼早期胚胎、分离gDNA。 

  将未受精的精子从麻醉的雄性中挤出，将卵母细胞从麻醉的雌性中挤出。受精胚在28.5℃的Holtfreter's溶液中生长，并根据标准形态学标准分期。将卵母细胞和不同阶段的胚胎在液氮中冷冻，直到收集到足够的胚胎用于DNA提取。 

  猪卵母细胞采集和体外成熟。  

  在屠宰场收集青春期前母猪的卵巢。用注射器吸出3-6mm的窦卵泡，收集卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。用PVA-TL-HEPES培养基洗涤三次，再用TCM-199培养基洗涤两次。随后，在5％CO2的潮湿气氛中，在38.5℃下不含激素的TCM-199培养基中使COCs成熟42- 44小时。然后，在工作溶液（0.03g透明质酸酶，5.46g甘露醇，0.001g BSA，5ml PVA-TL-HEPES和95ml ddH2O）中洗涤COC以除去卵丘细胞，并取出成熟卵母细胞，-80℃冻存。  

  体外受精。

  体外成熟后，用2ml新鲜IVF培养基轻轻洗涤COC以除去卵丘细胞。洗涤后，将裸露的卵母细胞置于50μL矿物油覆盖的IVF培养基中。将卵母细胞在38.5℃，5％CO2下孵育30分钟，直到加入精子。将卵母细胞与精子在IVF培养基中在38.5℃，5％CO2下孵育6小时。然后，将其转移到500μL PZM-3培养基中，再培养2天至4细胞期，4天至桑椹胚期，7天至囊胚期，-80℃冻存。  

  通过UHPLC-QQQ-MS/MS定量测定gDNA中的6mA。

  将在26μL不含核酸酶的H2O中的斑马鱼胚胎gDNA（20?300ng）或组织gDNA（1?2μg）在100℃变性5分钟，在冰上冷却2分钟，用1μL核酸酶P1消化，在10mM NH4OAc pH 5.3中于42℃过夜。之后加入3.4μL的NH4HCO3（1M）和1μL的磷酸二酯酶I在37℃下培养2小时，最后加入1 U碱性磷酸酶在37℃下培养2小时。将消化后的DNA用不含核酸酶的H2O稀释两倍，并通过0.22mm过滤器（Millipore，SLGVR04NL）过滤。将10μL样品注入LC-MS/MS中，并且通过反相UHPLC在C18柱（Agilent，927,700-092）上分离核苷，使用Agilent 6,460 QQQ-MS/MS在正电喷雾离子化模式下进行多反应监测。使用核苷前体离子鉴定碱基离子质量跃迁266.1-150.0为6mA，252.1-136.0为A。从同时运行的核苷标准获得的校准曲线进行6mA/A的定量。

  对于常规6mA-IP-seq，使用以下两种兔多克隆抗-6mA抗体：Synaptic Systems（SYSY，202,003）和Abcam，ab151,230。对于免疫染色实验，使用兔6mA抗体（SYSY，202,003）和小鼠单克隆组蛋白3（H3）抗体（Beijing Biodragon Immunotechnologies，B1055F）。

  免疫染色和共聚焦成像。

  对于6mA免疫染色，将斑马鱼胚胎在4％多聚甲醛中4℃固定过夜。然后去除胚胎并用甲醇脱水并用PBS再水化，用含有1％Triton X-100的PBS透化该胚15分钟。透化的胚胎用2M HCl变性1小时，然后用100mM Tris-HCl（pH8.5）中和20分钟。洗涤胚胎，然后用封闭缓冲液温育1小时。之后，将胚胎与6mA抗体（1:1000，SYSY抗体）在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤三次，将胚胎与1:2000稀释的第二抗体（山羊抗兔Alexa488，Molecular Probes）孵育。使用Nikon软件在Nikon Eclipse TI显微镜下获取图像。

  对于猪精子、卵母细胞和胚胎免疫染色，配子和胚胎用PBS洗涤，用PBS中的4％多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用0.1％Triton X-100在PBS中透化15分钟。将透化的配子和胚在室温下在4M HCl溶液中温育15分钟，然后在100mM Tris-Cl，pH 8.0中中和30分钟。封闭并用抗-6mA抗体孵育过夜后，将它们洗涤并与二抗温育。用DAPI染色细胞核。使用共焦激光扫描显微镜观察免疫荧光。

  6mA斑点印迹测定。

  斑点印迹：一种定性检测核酸或蛋白质的技术。将待测核酸或蛋白点样于固相载体上，以同位素或非同位素标记探针与之杂交，通过显影或显色而进行检测。

  98℃加热10分钟使DNA变性，并点在硝酸纤维素膜（GE Healthcare）上。将膜在80℃烘烤1小时并通过紫外线照射交联，将膜在含有0.5％Tween 20（PBST）的PBS中的5％BSA中在室温封闭1.5小时，然后与1:10,000稀释的6mA抗体（SYSY）在4℃过夜。用PBST洗涤三次后，将膜与1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的抗兔二抗孵育。然后用PBST洗涤膜并用增强的化学发光（ECL）处理。为了估计在不同阶段的斑马鱼gDNA中6mA的水平，用未甲基化的寡核苷酸稀释合成的含有6mA的DNA寡核苷酸，以产生具有6mA含量（0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125和0.00625％）的梯度的标准品。所有样品和标准品以相同的量装载。在我们测试的样品中，64细胞，256细胞，球体，13hpf和24hpf阶段的gDNA分别具有约0.05,0.01,0.004,0.002和0.002％的6mA水平，这与LC- MS / MS观察一致。

  含6mA的DNA寡核苷酸：

  5’-TTGCT（6mA）GGTGGTTGCT（6mA）GGCGGTTGCT（6mA）GGGT-3’

  DNA 6mA-IP-seq和生物信息学分析。

  在Illumina HiSeq2500平台上进行50bp单端测序。使用Bowtie v1.0.1将原始序列比对到参考基因组（zv10/danRer10，用于斑马鱼）。然后用MACS软件通过比较来自IP样品的读数与来自输入样品的读数来鉴定富集区域（6mA峰）。假发现率截止值设置为0.01，以选择统计学显着的峰。在获得这些峰区域之后，将基因座与从RepeatMasker数据库下载的重复元件的坐标进行比较。如果一个峰区域的一半以上的长度与一个注释的重复元件重叠，则将峰标记为重复起始峰。基因注释信息从UCSC数据库下载。分布在每个基因组区域中的峰的富集通过HOMER（MotgeEnrichment的Hypergeometric Optimization）软件。

  结果：

  1、 斑马鱼、猪早期胚胎发育期间DNA 6mA修饰 

  使用超高效液相色谱与三重四极杆串联质谱法纯化和定量基因组DNA（gDNA）（UHPLC-MS / MS / MS）测定，纯6mA核苷作为外标。  

  使用斑点印迹测定斑马鱼早期发育阶段的6mA水平，显示与LC-MS / MS实验一致的结果。  

  通过UHPLC-QQQ-MS / MS定量斑马鱼和猪的基因组DNA中的6mA。

  （a）从1细胞到512细胞的斑马鱼胚胎阶段的6mA丰度。从1细胞合子开始，DNA中6mA的水平随着发育进一步增加，并在对应于受精后2h的32细胞至64细胞胚胎阶段达到最大值。然后，6mA水平在512细胞阶段逐渐降低。  

  （b）来自成年斑马鱼的各种组织的6mA丰度。所有6mA丰度都相对较低。  

  （c）来自成年猪的各种组织的6mA丰度。所有6mA丰度都相对较低。

  2、 斑马鱼、猪早期胚胎中DNA 6mA水平的定量  

  通过UHPLC-QQQ-MS/MS对来自斑马鱼（a）和猪（c）的精子、卵母细胞和各种胚胎阶段的分离gDNA中的6mA修饰进行定量。 

  （b，d）通过抗6mA抗体（绿色，兔多克隆）和抗组蛋白3（H3）抗体（红色，小鼠单克隆）染色的单细胞水平的斑马鱼（b）和猪（d）的各个胚胎期的免疫荧光图像。早期胚胎阶段显示强的荧光，表明gDNA中6mA丰度较高，而信号随着胚胎发育的进展而减弱。

  3、 DNA 6mA-IP-seq显示6mA在斑马鱼各个胚胎阶段的基因组分布  

  在64C，11hpf，12hpf和13hpf的样品中鉴定了57,000至3,300个6mA峰，其中64C样品具有最多的峰，与6mA丰度测量一致。通常，6mA峰在转录起始位点（TSS）之后，在基因组中广泛分布并具有轻微富集，并且它们被发现在外显子富集，但不是内含子，基因间或启动子区富集。发现78-81％的峰位于重复元素（RE）中，表明6mA和RE之间的密切关系。

  （a）饼图显示64细胞期6mA峰的分布。  

  （b）64C、11hpf、12hpf、13hpf样本中6mA峰的分类。显示了基因组分布用于比较。峰用a中所示的相同标准分类。与基因组中RE区域的构成相比，6mA峰在简单重复序列、RC/Helitron（滚环转座子）、LTR（长末端重复反转录转座子）、LINE/L1（长散布元件）和DNA/Maverick（病毒样DNA转座子）类的RE富集。  

  （c）64C阶段样品中，简单重复、除了简单重复之外的其他RE和非重复区域（非RE）的6mA峰的序列motif。通过Homer软件搜索和产生基序。  

  为了寻找6mA的序列偏好，对6mA峰区域进行基序分析。考虑到RE和非RE区域之间的序列多样性，将峰分为三组：简单重复区、除简单重复之外的其他RE区和与RE不相关的区（非RE）。发现每个组的motif均不同。在简单重复中，串联CA基序是最普遍的，其后是串联的5’-TCCA-3’和5’-CCAA-3’基序。

  4、 选择含有6mA的靶基因

  为了研究富集6mA的REs的表达与积累的时间之间的相关性，选择了几个靶基因，并用qPCR来定量其在各种发育阶段的转录物表达水平。在所选择的靶基因中，Thy1（LTR/Gypsy）、Parp4（LTR/Gypsy）和Hel1（RC/Helitron）都显示随着发育、表达减少的趋势。这些数据表明REs的表达可能与6mA丰度正相关。

  亮点分析：  

  1、6mA作为原核DNA标记研究较为充分。在大肠杆菌中，6mA参与染色体复制，核型分离，错配修复和转录调节的控制。6mA也存在于真核生物中，并且似乎具有功能性作用。  

  2、研究表明，在斑马鱼和猪的早期胚胎发育期间，6mA可以积累到0.1-0.2％。卵母细胞中6mA的水平比精子的水平高几倍，并且在合子形成后，6mA的丰度增加，然后随着胚胎发育降低。  

  3、6mA优先选择在REs中富集，其表达可能与6mA丰度正相关。观察到的最高丰度6mA水平接近于在大多数哺乳动物组织中观察到的5hmC水平。未来的研究应该揭示6mA如何与哺乳动物的5mC重编程相关，6mA在REs和其他区域的作用，某些蛋白可能结合6mA以介导生物学功能。

  参考文献：  

  Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig.  

  2016-nature communication-11.329