降低微生物复杂度的宏基因组组装策略

  摘要

  当前绝大多数分析宏基因组项目的研究都要依赖参考基因组。而新的微生物群落则远远超越了参考基因组的数据库，同时针对复杂的微生物群落的宏基因组de novo组装也是一个巨大的挑战。本文展示了一个新的生物信息学分析方法（metaSort），目的是更有效地从宏基因组样品中组装出细菌的基因组。MetaSort是一种利用流式细胞仪和单细胞测序的方法来研究“微宏基因组”的策略，利用分类的“微宏基因组”和原始的宏基因组序列，采用新的计算方法来获得高质量的基因组。通过大量的评估证实，MetaSort具有很好的，无偏好性的恢复和组装基因组的性能。此外，研究者们利用MetaSort对一个未知的微生物群落—海带表面进行研究，一次性获得75个高质量的基因组。这种方法将大大的提高复杂或新微生物群落基因组的组装效果。

  材料方法  

  微生物样品：正常人的唾液10ml（室温离心机2500g，30s，去除大颗粒，上清液-80℃保存），新生婴儿5g粪便（室温离心机2500g，30s，去除大颗粒，上清液-80℃保存）；海带表面微生物（-80℃保存）。  

  细胞分离：流式细胞仪。 

  细胞样品DNA提取：EDTA法；DNA扩增（多重置换扩增）：Phi29 DNA聚合酶（REPLI-g Mini Kit）。 

  测序平台：原始的宏基因组DNA利用声波破碎成180bp，Illumina HiSeq 2000 PE100bp；PacBio SMRT平台，文库大小8kb。 

  宏基因组reads组装：SOAPdenovo v2.04；“微宏基因组”组装：SPAdes v3.15 

  计算机学习和图论算法：MGA。

  组装结果评估：QUAST。

  基因预测：PROKKA v1.11。

  进化树构建：FastTree v2.1.8，可视化：ITOL。

  研究结果

  1、MetaSort的研究策略

  2、MGA依靠局部的序列几乎可以恢复基因组全长

  100个微生物的系统进化树，模拟的包含100个微生物基因组的数据库，（86个细菌+14个古细菌）。

  A,组装结果的统计；B,为了证实MGA算法的效果（每个点代表一个基因组）；C,菌株水平变异的鉴定。

  3、MGA利用宏基因组和“微宏基因组”复原微生物基因组

  a, MGA组装的微宏基因组（标准化的测序深度，基因组覆盖度及增加的NGA75倍数）；b, MGA进行目标contig复原的三个步骤的特异性和敏感性比较分析；c, MGA进行目标contig复原的三个步骤；d,正常人唾液中微生物群落的contig连接图的构建过程；e,最终形成的正常人唾液中微生物群落的contig连接图。

  4、肠道微生物宏基因组样品菌株的变异水平

  a,MGA组装后肠道微生物中丰度最高的5种微生物NGA75长度及增加的基因组覆盖度；b,每种菌的变异水平；c,种内变异水平；d,两种菌分别在口腔和肠道中的变异水平。

  5、MetaSort 揭示了海带表面新的微生物群落结构

  a,属于5个门的75种组装好的微生物的系统发育树；b-e,利用三代测序的reads验证海带表面微生物的组装结果。

  6、海带表面新的微生物基因组的功能注释

  a,海洋和人的肠道微生物KEGG注释结果的比较；b,富集的水平转移基因；c,三种微生物群落的CAZyme基因的比较；d,海带3个浮霉菌科微生物的基因组特征。

  研究亮点  

  1、利用metasort技术将复杂的或者未知的微生物群落进行降低物种复杂度的方法，组装出该群落中的优势微生物的基因组，进而进行更加深入的研究。 

  2、分别针对人的口腔和肠道以及海带表面卫生物进行metasort技术构建微生物基因组的实验均获得成功，并且在海带中成功构建了75个高质量的微生物基因组。

  参考文献  

  MetaSort untangles metagenome assembly by reducing microbial community complexity[J].nature communications.IF=11.329