水稻全基因组关联分析揭示叶绿素含量的自然变异

  摘要  

  叶绿素是一种和叶片的光合作用及植株潜在产量密切相关的重要生理指标。目前关于水稻叶绿素含量自然变化的相关基因报道很少，而且发现这种变化范围也是受限制的。本文利用来自全球的529份水稻资源进行叶绿素含量的全基因组关联分析，共发现46个和叶绿素含量变化相关联的位点，并利用3个F2群体对这些关联的位点进行验证。利用近等基因系和转基因材料，发现在水稻的抽穗期，籽粒数、株高以及抽穗期（Ghd7）是和叶绿素含量变化相关联的。通过提高Ghd7的表达量能降低叶绿素的含量，主要原因是叶绿素和叶绿体的生物学合成基因的表达量下调。此外，通过对窄叶基因（NAL1）两年的表型数据研究发现，均和叶绿素含量变化显着相关。进一步研究发现在NAL1的5’ UTR区域具有大量的多态位点，以及编码区的4个非同义突变SNPs，并观察到主要的单倍型对应水稻不同性状的表现。

  材料方法  

  植物材料：529种水稻资源（199份中国水稻核心/微核心种质+129份国家水稻育种计划亲本材料+148份微核心种质（USDA）+18份水稻SNP计划材料+35份全球种质资源）。  

  测序方案：Illumina HiSeq 2000, PE90bp。（1Gb clean data/accession）  

  参考序列： japonica cv. Nipponbare version 6.1。  

  序列比对：BWA。SNP识别：SAMtools，BCFtools。  

  GWAS分析：FaST-LMM：LMM+LR（FaST linear mixed models for genome-wide association studies. Nat. Methods，2011. 8:833–835）。 

  R脚本：MLMM（An efficient multi-locus mixed-model approach for genome-wide association studies in structured populations. Nat. Genet. 2012，44:825–830.）。  

  qRT-PCR：RNA extraction kit (TransZol reagent;TransGene)，3ug 总RNA进行反转录。

  研究结果

  1、群体结构分析

  利用ADMIXTURE（188,637 SNPs）进行群体结构分析，K=6为最合理群体结构。

  2、叶绿素含量相关性状的表型变异

  SPAD值：表示叶绿素的相对含量。2012/2013两年表型鉴定，分蘖期SPAD（12SPAD、13SPAD）；抽穗期SPAD（12SPAD_FL、13SPAD_FL）。叶绿素a/b绝对量（chla、chlb）。

  总体上粳稻的叶绿素的相对含量高于籼稻。而TeJ在2012/2013年SPAD、SPAD_FL、chla、chlb含量均为最高，chla/chlb值最低。

    株高和叶绿素含量表现出明显的负相关。

  3、叶绿素含量相关性状的GWAS结果

  A/B：2013年529份水稻SPAD_FL的热图和直方图。C/D两种计算模型下（观察值和期望值间的相关性）。E/F/G三种计算模型下，全基因组范围内和SPAD_FL（抽穗期叶绿素相对含量）相关的位点。

  A/B：2013年籼稻SPAD_FL的热图和直方图。C/D两种计算模型下（观察值和期望值间的相关性）。E/F/G三种计算模型下，全基因组范围内和SPAD_FL（抽穗期叶绿素相对含量）相关的位点。

  2012年SPAD的全基因组相关位点（部分结论）。

  在不同时间，不同叶绿素含量相关性状下的GWAS分析的显着关联位点（17个区间，每个关联区间小于300kb）。

  4、叶绿素含量相关性状的GWAS结果的验证

  三个F2定位群体对各种叶绿素含量相关主效QTL的定位结果，以及与GWAS结果相互印证的统计分析。

  5、响应水稻抽穗期叶绿素相对含量变化的主要位点，Ghd7

  水稻的不同亚种，Ghd7的不同单倍型对应的叶绿素相对含量。

  Ghd7的表达量和叶绿素含量负相关，与叶绿素a/叶绿素b的比值正相关。

  与Ghd7近等基因系及Ghd7的转基因阴性植株相比，Ghd7的转基因阳性植株叶绿素含量更低，但叶绿素a/叶绿素b的比值更高。明恢63（Ghd7近等基因系）的叶绿素含量低于珍汕97（Ghd7近等基因系），叶绿素a/叶绿素b的比值高于珍汕97（Ghd7近等基因系）。

  Ghd7转基因植株与野生植株相比（幼嫩叶片+正在生长的花序），与叶绿素代谢和叶绿体生物合成相关基因均表现为下调表达。

  珍汕97和明恢63 ：Ghd7近等基因系的8个基因的相对表达量。

  6、窄叶基因NAL1对应的叶绿素含量GWAS关联位点

  NAL1的四种单倍型。

  籼稻的四种单倍型对应的叶绿素含量、旗叶的长/宽、每个水稻花序的小穗数。单倍型3的叶绿素含量指标最高，旗叶最短和每个水稻花序的小穗数最少。

  7、对抽穗期叶绿素相对含量的候选基因LOC_Os09g25150的分析

  A，SPAD_FL候选基因的6种单倍型。B，每组每种单倍型对应的个体数。HAP1，HAP2（粳稻）；HAP3、HAP4、HAP5（籼稻）。

  A：TeJ亚组中LOC_Os09g25150的单倍型及对应SPAD_FL。B：两种单倍型的相对表达量分析。

  研究亮点

  1、用来自全球的529份水稻种质资源，对水稻分蘖期、抽穗期的叶绿素含量进行全基因组关联分析，获得46个显着相关位点。并利用3个F2群体的进行QTL定位来验证GWAS的关联结果。  

  2、经过连续两年的表型鉴定，发现粳稻的叶绿素含量高于籼稻。且根据群体结构分析，粳稻的一个亚组TeJ的叶绿素平均含量最高。  

  3，对抽穗期基因Ghd7与叶绿素含量的相关性进行研究发现，Ghd7的表达量和叶绿素含量呈负相关的关系（分别在近等基因系和转基因植株中得到证实）原因是：Ghd7的上调表达导致与叶绿素代谢和叶绿体生物合成相关基因均表现为下调表达。对GWAS关联到的窄叶基因（NAL1）与叶绿素含量的相关性进行研究发现，NAL1的单倍型3的叶绿素含量指标最高，旗叶最短和每个水稻花序的小穗数最少。  

  4，qRT-PCR结果表明：候选基因LOC_Os09g25150（编码二乙烯基原叶绿素酸脂还原酶）的HAP1单倍型很有可能是和叶绿素含量相关的基因。

  参考文献 

  Genetic Architecture of Natural Variation in Rice Chlorophyll Content Revealed by a Genome-Wide Association Study[J].Mol Plant.IF=7.142