代谢组学研究基因型和农艺条件对所选的草莓栽培品种的影响

  摘要  

  草莓是世界上最具经济重要性和广泛栽培的水果作物之一，因此越来越需要开发用于鉴定品种和来源的新的分析方法，以及评估农业和加工方法。在这项工作中，基于气相色谱质谱（GC-MS）结合多变量统计技术的非靶标代谢组学策略第一次用于分析不同草莓品种的主要代谢组学特征，并研究响应多种农学条件下代谢物的变化。为此，我们调查了三种对环境胁迫具有不同敏感性的草莓品种(Camarosa, Festival 和 Palomar)，在无土系统中使用不同电导率，覆盖范围和底物进行栽培。代谢组学分析揭示了在不同作物条件下培养的三种草莓栽培品种之间初级代谢物（包括糖（果糖，葡萄糖），有机酸（苹果酸，柠檬酸）和氨基酸 （丙氨酸，苏氨酸，天冬氨酸））的显着变化。因此，可以得出结论，基于GC-MS的代谢组学是区分不同草莓栽培品种和分析与环境和农艺条件相关的代谢组学变化特征的合适手段。

  材料方法

  材料与样品  

  甲醇和吡啶（HPLC级）以及用于衍生化的试剂N-甲基-N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）和甲氧基胺盐酸盐购自SigmaeAldrich（Steinheim，Germany）。 果糖，葡萄糖，苹果酸，柠檬酸，草酸，酒石酸和抗坏血酸的标准品获自Merck（Darmstadt，Germany），蔗糖和核糖醇（内标）购自Panreac（巴塞罗那，西班牙），酪氨酸，苏氨酸，丝氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，脯氨酸和缬氨酸购自SigmaeAldrich（Steinheim，Germany）。

  植物材料，生长条件和取样  

  该研究在西班牙西南部的韦尔瓦大学（纬度37-140N，经度6_530W，高度23m）管理的实验种植园中进行，其中草莓植物（Fragariax ananassa Duch。）在无土系统中生长。该实验是根据最近发布的与收获时间和作物条件的草莓质量相关研究的重复（第二年）（Akhatou和Fern_andez-Recamales，2014a），因此在本文中可以找到样品的详细描述。简而言之，实验设计由两个（macrotunnels）大穗组成（覆盖和未覆盖），每个包含三种在不同电导率（EC≤1,2和3dS / m）下生长的植物育种系。每行育种植物由三个草莓栽培品种（Palomar，Festival和Camarosa）组成。最后，将每个栽培品种置于三种不同的基质（椰子纤维，珍珠岩和岩棉）中生长。这三种草莓品种是基于对环境条件敏感性的选择：Palomar（PAL，非常敏感），Festival（FES，敏感）和Camarosa（CAM，抗性）。收获后立即将果实分类，在冷冻冰箱中原位冷冻，并以聚苯乙烯穿孔器运送到我们的实验室。洗涤果实，切下萼片，最后，通过厨房混合器轻轻匀浆果实。随后将所获得的糊剂储存在-20度用于进一步分析。

  样品制备  

  对于代谢物的提取，将匀浆的果实（0.5g）与10mL甲醇/水（1:1，v / v）混合，然后将混合物在室温下涡旋10分钟，并在10,000rpm 4度离心10 min。然后将20ml提取物与30mL作为内标的核糖醇（0.2mg / mL，溶于水中）混合，并在氮气流下干燥。随后，按照先前优化的两步法进行衍生化（Gonz_alez-Domínguez et al，2015）。为了通过甲氧基化保护羰基基团，将干燥的提取物复溶于50mL的甲氧基胺浓度为20mg/mL的吡啶溶液中，在短暂涡旋后， 80℃水浴下温育15分钟。然后，通过加入50mL的MSTFA进行甲硅烷基化，并在80℃再次温育15分钟。最后，将衍生化的样品平衡至室温，并在注射前以4000rpm离心5分钟。对每个样品制备三个分析重复。

  GC-MS 分析  

  色谱分析按照Zhang等人描述的方法稍作了一些修改进行。Varian CP 3800气相色谱仪偶联离子阱质谱仪检测Saturn 2200，使用因子四熔融石英毛细管柱（VF-5MS 30m_0.25mm内径，0.25mm膜厚度固定相， Varian）。GC程序设置为初始温度在100℃持续2分钟; 增加到140度按5 ℃/min持续3分钟;增加到180度按5 ℃/min持续6分钟; 按5 ℃/min增加到320度，最后保持5分钟。将注射器温度保持在250℃，以不分流模式（1mL）以恒定流速1mL/min注射样品，使用氦气作为载气。重要的MS操作参数如下：离子源温度设定在200℃，通过使用70eV电压的电子冲击进行电离。获得在m / z范围40-600中的全扫描光谱的数据。

  数据处理  

  在统计分析之前，需要处理获得的分析数据以便将同一性分配给每个样品中的相同变量。为此，原始数据按Katajamaa（2007）描述的途径进行处理，通过包括特征检测，峰的对准和归一化的多个阶段进行。为此，我们使用包括在R平台（http://www.r-project.org）中的免费可用的软件XCMS。使用Varian SMS导入转换器工具（Open-Chrom）将GC-MS文件转换成netCDF，随后使用匹配的Filter方法提取数据。对于数据归一化，使用局部加权散点图平滑（LOESS）归一化方法，其调整数据集中样品之间的峰强度的对数倍数变化的局部中值在整个峰强度范围内设置近似为零（Veselkov等人，2011）。最后，数据以对数变换方式提交，以稳定结果的方差。预处理数据然后导出为a.csv文件，用于通过多变量过程进一步数据分析。

  数据分析  

  通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对数据进行多变量分析，以使用SIMCA-P TM软件（版本11.5，UMetrics AB，Ume?，Sweden）比较获得的代谢组学概况。在进行统计分析之前，将数据提交给Pareto scaling（标准偏差的平方根用作缩放因子）以减小较大值的相对重要性，以及对数变换使其近似正态分布。 Hotelling T2区定义了模型变化的95％置信区间，并且在模型的分数图中显示为椭圆。模型的质量通过R2和Q2值来评估，它们分别提供关于模型的类别分离和预测能力的信息。这些参数范围在0和1之间，它们显示了由模型通过交叉验证（Q2）分析的所有数据（R2）的变化。最后，根据投影中的可变重要性VIP（PLS权重的加权平方和，其指示变量在模型中的重要性）选择最有影响力的变量，仅考虑VIP值高于1.5，表明各组之间存在显着差异。此外，使用STATISTICA 8.0软件（StatSoft，Tulsa，USA）通过单向方差分析和非参数检验进行组比较。只有p值低于0.05被认为是具有统计学显着差异的。

  潜在生物标志物的鉴定  

  使用NIST质谱库暂时鉴定由GC-MS检测的差异代谢物，仅考虑相似性指数（SI）大于70％的那些变量。 然后，通过注射标准品来鉴定这些潜在标记物。

  结果与讨论  

  基于先前描述的GC-MS分析的代谢组学方法应用于在无土系统中生长的三个草莓栽培种以确定初级代谢物的差异。 经过原始数据处理后，数据由54行（样品）和254列（具有不同m / z比和保留时间的强度形式的变量）组成的矩阵被Pareto缩放，得到最合适的模型，然后进行化学计量分析。作为第一步，在应用任何监督统计分析之前，应用主成分分析（PCA）对数据质量进行初步评估。这种无监督的方法允许获得数据的整体概述，并且识别可能的异常值和样本分组的趋势。当PCA应用于数据时，获得特征值高于1（Kaiser准则）的40个潜在变量（主成分）。然而，ANOVA测试显示只有前三个组分是显着的（p<0.001），其分别为原始方差的24.9,17.3和6.3％。

  图1显示了样品在由前三个组分定义的空间中的分布，其中可观察到草莓栽培品种之间的明显区别，表明这三个品种之间的代谢差异。此外，发现一个有趣的特征：三个品种以反映它们对环境胁迫的敏感性的方式沿着PC1的方向排列。cv.Camarosa（抗性）比cv. Festival（敏感）和cv. Palomar（非常敏感）样品具有更高的分数。后者的PC1得分最低。此外，Festival和Palomar样本可以通过PC2明确分离，分别具有阴性和阳性PC2得分。

  Fig. 1. 所有样品的PCA模型的三维得分图。 Camarosa：浅灰色， Festival：深灰色，Palomar：黑色

  处理这些结果，应用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）以获得足够的分类模型。 PLS-DA是使用虚拟矩阵（Y）解释数据集（X）中的最大变化的监督方法，其可以用于锐化或观察组之间的分离状态。 为了理解种间分离和鉴定每个栽培种的潜在特征标记，开发了三个二元模型。 前两个模型比较cv. Camarosa与其他两个品种，Festival and Palomar。 在这两种情况下，获得符合质量参数R2和Q2的值，上述方差为95％，预测方差约为80％。 第三个模型是用来自Festival和Palomar草莓的数据开发的。 在该两个组分模型中，通过7重交叉验证获得的R2和Q2值分别为0.95和0.739。

  Fig. 2. .用于两类比较的PLS-DA模型的分数和载荷图

  （A）Festival 与Camarosa比较的分数图，（B）Palomar与Camarosa比较的分数图，（C）Palomar与 Festival比较的分数图，（D）Festival 与Camarosa比较的载荷图，（E）Palomar与Camarosa比较的载荷图，（F）Palomar与 Festival比较的载荷图。

  图2（A-C）显示了对于三种草莓栽培品种获得的分数图，根据前两种组分进行分组。可以观察到，在所有情况下，品种间均被清楚地区分。另一方面，PLS-DA载量图的评估（图2 D-F）更好地理解变量有助于分类。此外，PLS模型还提供了通过（VIP）变量重要性投影参数获得每个变量识别率的定量测量的可能性。仅选择VIP值高于1.5的变量用于鉴定有助于品种间分离的代谢物。因此，这些负荷曲线图的检查表明，与Festival和Palomar品种相比，Camarosa草莓品种中的肌醇，柠檬酸，丙氨酸，正缬氨酸，苏氨酸和天冬氨酸的代谢物增加（图2 D-E）。Camarosa和Festival品种的负荷曲线图（图 2D）还表明，Camarosa草莓与Festival品种相比含有较少的糖（葡萄糖和果糖）和苹果酸。另一方面，（图 2F）显示的负载曲线图表明与Palomar相比，在Festival草莓品种中显示出相对高水平的葡萄糖，果糖和苹果酸。最后，通过使用非参数单变量分析方法如ManneWhitney U检验（p ≤ 0.05）验证这些代谢物，假定大多数变量显示偏态分布（通过正态概率图检查），并且方差不均匀（通过Levene检验）。

  表1 通过GC-MS谱对不同草莓栽培品种中差异代谢物的鉴定

  本研究中鉴定的差异代谢物列于表 1中，连同实验保留时间，变化百分比和每个比较的p值(Festival vs. Camarosa, Palomar vs. Camarosa, Palomar vs. Festival)。

  Fig. 3.用GC-MS分析鉴定不同草莓栽培品种中差异代谢物的虚线箱线图

  此外，代表所选代谢物的标准偏差间隔平均值的箱线图显示在图 3中以突出三个品种之间的代谢组学差异。尽管在统计学上差异显着，在品种之间的代谢变化不是非常明显，特别是对于氨基酸，可能是由培养草莓的对照条件导致的。在这个意义上，值得注意的是，本研究中计算的差异倍数与以前着重于草莓品种生化差异的计算方式非常类似。

  除了基因型的影响，果实的营养质量也受到培养植物的环境和农艺条件的显着影响。植物生长和产量的重要因素之一是土壤类型和气候条件，如先前不同品种草莓（Cocco等，2015）和蓝莓（Nestbyet等，2014）报道所述。此外Pradas等还研究了季节和成熟阶段对草莓果实不同性质（包括颜色，坚实度，酸度，可溶性固体含量，抗氧化能力和多酚含量）的影响。值得注意的是，临界温度可能导致较低的果实产量（Nestby和Takeda，2015）。为了评估本研究中与草莓生长条件相关的代谢变化，将PLS-DA应用于前述的GC-MS数据集，考虑不同的农学条件作为分类因素（即大通道类型，电导率和基质）。为此，每个品种构建三个统计模型，并且通过表 2中列出的参数R2和Q2评估这些模型。

  表2 根据生长条件（覆盖类型，传导率和基质）对草莓分类PLS-DA模型的统计参数

  考虑电导率作为分类因子，PLS-DA得分图显示样品之间分离度很差，导致模型的可预测性低，如表2所示Camarosa，Festival和Palomar的电导率分别由Q2值-0.13，-0.21和0.021表示。在不同电导率下生长的样品之间的最大显着差异是cv.Camarosa的柠檬酸，丙氨酸和肌醇；cv. Festival的柠檬酸和丙氨酸；cv. Palomar的柠檬酸，苹果酸，葡萄糖，甘油和丙氨酸。 对于这三个品种，当电导率从EC1增加到EC2时，可以观察到柠檬酸含量的减少。 然而，如果电导率增加到EC3，柠檬酸仅仅在cv. Camarosa中稍微增加，而在cvs. Festival 和Palomar中显着降低（约65％）。 此外，还值得注意的是，电导率的增加导致所研究的三个品种中丙氨酸的水平降低，cv. Camarosa中肌醇的增加，以及在cv. Palomar中甘油的增加和苹果酸的降低，而葡萄糖保持恒定。 这些结果与Keutgen和Pawelzik报道的结果一致。

  此外，草莓样品也根据用于生长基质（即椰子纤维，珍珠岩和石棉）建模。 这些双组分模型显示了Camarosa，Festival和Palomar的方差分别为21.8,16.6和16.8％，但PLS-DA分数图表明基质之间分离度差（数据未在文中显示），导致样本预测性低，由表2中Q2的低值表示。 在这种情况下，用于区分组间的显着代谢物是cv. Camarosa的柠檬酸；cv. Festival的柠檬酸，葡萄糖，苏氨酸和天冬氨酸；cv. Palomar的柠檬酸，果糖，葡萄糖和甘油，与之前的结果一致。

  表3 通过GC-MS分析鉴定在无土系统栽培的草莓品种中与不同生长条件相关的差异代谢物

  根据以前描述的途径选择的差异代谢物显示在表 3中，包括实验保留时间，变化百分比和每个比较的p值（覆盖vs未覆盖，EC3 vs EC2 vs EC1，珍珠岩vs椰子纤维，石棉vs椰子纤维，珍珠岩vs石棉）。

  亮点：      

  1.验证了与质谱偶联的气相色谱法是研究草莓果实初级代谢物的合适的代谢组学工具。  

  2.鉴定了多种标志化合物（L-丙氨酸，L-正缬氨酸，L-苏氨酸，L-天冬氨酸，苹果酸，柠檬酸，D-果糖，D-葡萄糖，甘油和肌醇），其与三个草莓栽培品种的感官特征或不同农艺条件下环境胁迫产生的耐受机制相关。  

  3.同时研究了草莓不同基因型和农艺条件下的差异代谢组学。

  参考文献：  

  Investigation of the effect of genotype and agronomic conditions on metabolomic profiles of selected strawberry cultivars with different sensitivity to environmental stress  

  Plant Physiology and Biochemistry(2016) IF=2.928