拟南芥NF-YCs通过调节组蛋白乙酰化介导下胚轴延长的光控制

  摘要：  

  光是促进光形态发生的关键环境信号，发育过程包含一系列植物对光的依赖性改变，以适应各种外部挑战。已经提出染色质修饰涉及这种光介导的生长，但是其潜在的机制仍然是难以捉摸的。本文发现四种拟南芥核因子-YC同源物NF-YC1，NF-YC3，NF-YC4和NF-YC9（NF-YCs）功能冗余，通过组蛋白去乙酰化作为下胚轴延长的光控制的阻遏物。在光照条件下生长的失去功能的NF-YCs突变体幼苗中，观察到明显的黄化表型，包括显着伸长的下胚轴、较小开放的子叶。研究结果显示，在光照下，NF-YCs与HDA15（一种组蛋白脱乙酰酶）共同作用，靶向于下胚轴延长相关基因的启动子，并在相关的染色质调节组蛋白H4乙酰化水平，从而抑制基因表达。相反，NF-YC-HDA15复合物在黑暗中从靶基因中消除，导致H4乙酰化增加，植物生长。进一步分析证实，NF-YCs对下胚轴延伸的光控制的转录抑制活性部分取决于HDA15的去乙酰化功能，且HDA15功能的丧失，补救了NF-YCs过表达植物的短的下胚轴表型。总而言之，我们的研究结果揭示了NF-YCs与HDA15作为转录共抑制因子，在早期幼苗阶段，抑制光形态发生中下胚轴延长的作用，表明NF-YCs通过表观遗传调节植物发育以响应环境改变。

  材料与方法：

  材料：拟南芥植物。  

  取材方法：将表面灭菌的拟南芥种子接种在含有0.3％蔗糖和0.8％琼脂的培养基上。4℃下在黑暗中孵育3天后，用6h白光照射种子使之发芽。然后在22℃下，用持续的红光、远红光、蓝光或黑暗使之生长。22℃下，成年植株在土壤中用全光谱白荧光灯（16h光/ 8h黑暗）照射生长。

  表型分析：在指定的各种光照条件下生长的幼苗用数码相机拍照。使用Image J软件测量下胚轴长度、子叶角度、叶柄长度和叶片角度。各个处理的各基因型至少收集30个幼苗的数据。  

  RNA提取：E.Z.N.A. Total RNA Kit I (Omega)。

  测序策略和分析流程：  

  测序：Illumina HiSeq2000。（Col野生型和nf-ycQ的幼苗在持续的红光照射下在1/2 MS平板上生长2天，然后收集样本，设三个生物学重复。）  

  分析：GO分析：BiNGO software；  

  HDA15和NF-YCs共调节基因的富集显着性分析：χ2 test analysis。

  结果：

  1、 NF-YC同源物在光形态生长中发挥积极作用  

  在拟南芥中，NF-YC属于含有13个成员的多基因家族。 NF-YC1，NF-YC3，NF-YC4和NF-YC9是NF-YC家族中最接近的NF-YC同源物。为了研究NF-YC在光形态发生中的功能，我们分析了光介导的生长表型的nf-yc1-1，nf-yc3-2，nf-yc4-1和nf-yc9-1单一和组合T-DNA插入突变体。在多种光照或黑暗条件下，所有单个突变体，nf-yc3/4/9和Columbia野生型（Col）幼苗的各种双突变体之间的下胚轴伸长率几乎没有差异。而nf-yc3-2、nf-yc4-1、nf-yc9-1三重突变体（nf-ycT）和nf-yc1-1、nf-yc3-2、nf-yc4-1、nf-yc9-1四重突变体（nf- ycQ）幼苗在白色、红色、远红色、蓝色光条件下表现出比Col更长的下胚轴，而它们在黑暗中没有显示出差异（图1A和1B）。为了进一步证实NF-YCs在光形态发生中的作用，通过定量实时PCR（qRT-PCR）检查几种下胚轴延长相关基因的表达。与幼苗表型一致，生长素反应基因IAA6和IAA19，GA响应基因PRE1和细胞壁松动酶基因XTH17在nf-ycQ中显着上调，而NF-YC3OE和NF-YC9OE中下调（图1C）。这些结果支持NF-YC同源物在光形态发生中发挥积极作用，通过作为下胚轴延伸的光控制中的阻遏物起作用。

  NF-YCs在各种光条件下抑制下胚轴伸长。

  （A）在红、远红、蓝光或黑暗条件下生长4天和白光下7天的Col，nf-ycQ，NF-YC3OE和NF-YC9OE幼苗的下胚轴表型。nf-ycQ表示nf-yc1-1、nf-yc3-2、nf-yc4-1、nf-yc9-1四联突变体；OE＃1和OE＃2表示NF-YC3和NF-YC9的不同个体过表达株系。  

  （B）（A）中所示的幼苗的下胚轴长度统计。数据由至少30株幼苗的平均值得到。星号表示与Col野生型相比有显着差异。  

  （C）在红光下生长2天的Col、nf-ycQ、NF-YC3OE和NF-YC9OE转基因幼苗中下胚轴延长相关基因的相对表达分析。星号表示与Col野生型相比有显着差异。TUB2作为内参。

  2、 NF-YCs与HDA15相互作用

  （A）酵母双杂交实验显示NF-YC同源物与HDA15之间的相互作用。转化的酵母细胞在SD / -Trp / -Leu / -His / -Ade和SD / -Trp / -Leu培养基上生长。发现NF-YC3，NF-YC4和NF-YC9与酵母中的HDA15（拟南芥组蛋白脱乙酰酶）有强烈的相互作用。  

  （B）蛋白质体外结合实验显示His-NF-YC1，His-NF-YC3，His-NF-YC4或His-NF-YC9和GST-HDA15重组蛋白之间的直接相互作用。将His标记的蛋白与GST（谷胱甘肽S-转移酶）或GST-HDA15蛋白孵育，并通过抗His抗体检测免疫沉淀的组分。箭头和三角形分别表示GST-HDA15和GST。通过GST-HDA15可以共沉淀His-NF-YC1，His-NF-YC3，His-NF-YC4和His-NF-YC9，而通过GST不可以，证明NF-YCs和HDA15之间的物理相互作用。  

  （C）烟草表皮细胞中NF-YC9和HDA15之间的相互作用的BiFC（双分子荧光互补）分析。EYFP，增强黄色荧光蛋白的荧光；DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚的荧光，用作核指示剂；Merge，EYFP和DAPI合并。结果表明，EYFPN-HDA15/NF-YC9-EYFPC的共表达在细胞核中重建了功能性EYFP，而对照没有。  

  （D）植物中NF-YC9和HDA15之间的相互作用的免疫共沉淀测定。提取两天龄在连续红光或黑暗下生长的NF-YC9-FLAG和HDA15-GFP的幼苗植物核，通过抗FLAG抗体或前体血清（IgG）免疫沉淀。通过抗GFP或抗FLAG抗体检测共免疫沉淀的蛋白。箭头表示HDA15-GFP条带，星号表示非特异性条带。证实植物中NF-YC9和HDA15之间的相互作用发生在光照下，而不是黑暗条件中。

  3、 HDA15抑制在各种光条件下的下胚轴伸长。  

  （A）在红光、远红光、蓝光或黑暗条件下生长4天和白光7天的Col、hda15和HDA15-GFP幼苗的下胚轴表型。hda15显示延长的下胚轴表型，而HDA15-GFP具有比野生型更短的下胚轴。  

  （B）（A）中所示的幼苗的下胚轴长度统计。数据由至少30株幼苗的平均值得到。星号表示与Col野生型相比有显着差异。hda15和HDA15-GFP在黑暗中与野生型幼苗没有表现出差异。意味着NF-YCs可能与HDA15一起抑制光条件下的下胚轴伸长。  

  （C）在红光下生长2天的Col、hda15和HDA15-GFP转基因幼苗中的下胚轴延长相关基因的相对表达分析。星号表示与Col野生型相比有显着差异。TUB2作为内参。

  4、 NF-YCs和HDA15靶作用于下胚轴伸长基因的启动子。  

  （A）用于ChIP-qPCR分析的IAA19和XTH17的示意图。黑色方框表示外显子，白色方框表示非翻译区（UTR）。P1至P3表示ChIP-qPCR扩增的片段。  

  （B、C）NF-YC9（B）和HDA15（C）与IAA19和XTH17启动子区域结合的ChIP分析。NF-YC9、HDA15和Col野生型幼苗在红光（RL）或黑暗（D）下生长2 d，然后收获用于ChIP-qPCR分析。结果表明，NF-YC9与IAA19启动子中P1和P2区域以及光生长幼苗中XTH17启动子区域P2和P3强烈结合。  

  （D）在（E）中的瞬时表达测定中使用的效应物和报告物构建体的示意图。为了进一步检查NF-YC和HDA15对靶基因表达的抑制活性，使用与β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）基因融合的IAA19启动子的?2kb片段作为报告子进行瞬时表达测定。  

  （E）瞬时表达测定，表明IAA19的表达被NF-YC9和HDA15协同抑制。通过相对GUS活性（GUS /LUC荧光素酶）计算IAA19活性。结果显示，单独的HDA15或NF-YC9对IAA19基因表达呈现显着的抑制作用。显着地，当共表达HDA15和NF-YC9时观察到GUS活性的更显着降低，证明NF-YC9和HDA15协同抑制靶基因表达。

  5、 NF-YC在下胚轴伸长中的抑制作用取决于HDA15的功能。  

  （A）在红光下生长4天的Col、hda15、nf-ycQ、hda15nf-ycQ、NF-YC3OE、hda15 NF-YC3OE、NF-YC9OE和hda15NF-YC9OE幼苗的下胚轴表型。与hda15、nf-ycQ和野生型幼苗相比，双突变体hda15 nf-ycQ在光条件下显示极长的下胚轴表型。  

  （B）（A）中所示的幼苗的下胚轴长度统计。数据由至少30株幼苗的平均值得到。星号表示与Col野生型相比有显着差异。  

  （C）在红光下生长2天的Col、hda15、nf-ycQ、hda15nf-ycQ、NF-YC3OE、hda15 NF-YC3OE、NF-YC9OE和hda15NF-YC9OE幼苗中下胚轴延伸相关基因的相对表达分析。星号表示突变体和Col野生型之间有显着差异。TUB2作为内参。下胚轴延长相关基因的表达显着增加，证实了HDA15和NF-YC在抑制下胚轴延长方面的协同调节。hda15 NF-YC3OE或hda15 NF-YC9OE中下胚轴延伸相关基因的表达也显着高于NF-YC过表达株系中的表达，表明NF-YC对光下胚轴伸长的抑制作用部分取决于HDA15功能。

  6、 NF-YCs和HDA15共调节基因的全基因组转录组分析。  

  为了分析NF-YC在光信号通路中的调节表达谱，我们对在红光条件下生长的Col野生型和nf-ycQ幼苗进行转录组学分析。  

  （A）维恩图显示了NF-YC和HDA15共抑制和共激活的基因的重叠。重叠显着富集（χ2检验，p<0.01）。  

  （B）NF-YCs和HDA15共调节基因的David功能聚簇。由NF-YC和HDA15共抑制的基因涉及糖苷酸生物合成过程、种子贮藏蛋白、亮氨酸生物合成过程、血红素、细胞壁、硫氧还蛋白折叠、水转运蛋白活性、类黄酮生物合成过程和氧结合。  

  7、 NF-YCs和HDA15在光控制下调节H4乙酰化水平。  

  （A、B）在红光（A）和黑暗（B）下Col、hda15、nf-ycQ和hda15nf-ycQ突变体中IAA19和XTH17基因中H4乙酰化水平的ChIP分析。与野生型相比，红色光生长的hda15幼苗中IAA19和XTH17染色质中的H4ac水平增加。相比之下，H4ac在黑暗生长的hda15和nf-ycQ幼苗中的水平与红光相比显着减少。  

  （C）红光下Col、NF-YC9OE和hda15NF-YC9OE幼苗中IAA19和XTH17启动子处H4乙酰化水平的ChIP分析。与在nf-ycQ中H4ac水平的强烈增加相反，NF-YC9的过表达显着地减弱了光控制下IAA19和XTH17染色质的H4ac水平。HDA15的功能丧失完全恢复了NF-YC9OE幼苗中降低的H4ac水平，表明NF-YCs对H4脱乙酰化的作用取决于HDA15的功能。  

  （D）NF-YCs和HDA15协同调节光控制下的细胞伸长的假设模型。在光照下，NF-Y复合物的NF-YC亚基与HDA15相互作用，并识别下胚轴延长相关基因（例如IAA19和XTH17）的启动子，从而通过H4脱乙酰化、促进光形态生长，抑制它们的表达。在黑暗中，HDA15与靶基因解离，导致这些基因座中的H4乙酰化水平升高。染色质随后招募黑暗相关的转录因子，以促进下胚轴延长相关基因的表达和黄化生长。NF-YCs和HDA15通过介导组织蛋白乙酰化的靶位点，共抑制下胚轴延长的光控制。

  备注：  

  文章中的RNA-seq部分是由南京集思慧远生物科技有限公司提供的测序、分析和数据上传的服务。

  参考文献：  

  Arabidopsis NF-YCs mediate the light control of hypocotyl elongation via modulating histone acetylation.  

  Molecular Plant. 2016 IF=7.142