木豆抗木豆枯萎病和不育花叶病候选基因的鉴定

  摘要

  本研究为了定位木豆枯萎病和不育花叶病基因，采用了集群分离分析（BSA）的测序方法。抗病和感病混池均来自（ICPL 20096 x ICPL 332）的重组自交系群体子代。利用木豆基因组草图计算抗、感池的SNP index，最终获得了7个木豆枯萎病和不育花叶病的候选SNPs位点。同时另外增加了4个其他基因型的木豆进行重测序，与BSA结果一起统计，一共检测到8362个非同义突变SNPs。在这8362个SNPs中，有60个SNPs位点在BSA检测到的7个候选SNPs的侧翼2Mb的范围内。单体型分析结果将范围缩小到7个基因的8个非同义突变SNPs内。这8个候选SNPs进一步在抗、感不同的11个基因型木豆中进行重测序的结果验证。这些分析获得了与抗枯萎病相关的4个基因中的4个候选非同义突变SNPs，以及抗不育花叶病3个基因中的4个候选非同义突变SNPs。进一步的蛋白注释和表达的分析最终确定两个最后可能的候选基因，抗不育花叶病基因C.cajan_01839和抗枯萎病基因C.cajan_03203。鉴定到的候选区间/SNPs将对木豆的遗传辅助育种是有用的。

  材料方法  

  植物材料：共11种基因型木豆，其中抗枯萎病：ICPL20096，ICPL99050，ICPL20097，ICPL8863，ICPL87119，HPL24。抗不育花叶病：ICPL20096，ICPL99050，ICPL20097，ICPB2049，ICPL87119，ICPL85063。  

  ICPL20096（抗枯萎病、不育花叶病）与ICPL332（感枯萎病、不育花叶病）杂交构建一个包含188个单株的F7 RIL群体。  

  测序方案：抗病亲本ICPL20096（14.85X），从包含188个单株的F7 RIL群体中各挑选16个极端的抗（13.91X）、感（15.3X）子代进行混池测序。另外10个基因型材料(ICPL20096，ICP8863，ICPB2049，ICPL20097，ICPL99050，ICPL332，HPL24，ICP85063，ICPL87，ICPL88039)进行全基因组重测序，参考基因组：Asha。 

  挑选的四个进行非同义突变SNPs鉴定：ICPL20097(R-FW，R-SMD)，ICP8863 (R-FW，S-SMD)，ICPB2049(S-FW，R-SMD)，ICPL99050(R-FW，R-SMD)。DNA提取：2-3片幼叶，NucleoSpin Plant II kit。  

  测序平台：Illumina MiSeq PE250bp，文库大小：500-600bp。  

  蛋白结构分析：Phyre 2。  

  ΔSNP index=SNP index in R-bulk- SNP index in S-bulk

  研究结果

  1、混池样品的选取

  从188个RIL的单株中各挑选16株抗病和感病的木豆，混成抗感池。

  2，全基因组范围内SNP分析

  木豆11条染色体上每个窗口的SNP数量。

  抗感池中SNP的分布情况。

  3，全基因组范围内SNP index分析

  分析7个候选SNPs与附近SNPs的卡方检测结果表明这些SNPs与候选SNP之间不符合期望的共分离类型，而这7个候选SNPs即为导致木豆植株抗性的位点。

  4，全基因组范围内非同义突变SNP分析

  5，BSA与非同义突变SNP联合分析

  圈图由外到内：A，木豆参考基因组Asha的假设染色体。B，抗、感池之间全基因组范围内的非同义突变SNPs。C，通过ΔSNP index关联到的候选基因内部的非同义突变位点。D，上概率p<0.01下候选位点。E，上概率p<0.05下候选位点。F、G，绿色部分表示SNP index的变化从0~1。H，下概率p<0.01下候选位点。I，下概率p<0.05下候选位点。J，红色部分表示SNP index的变化从0~-1。K，候选的非同义突变位点的2Mb的区间。

  6，非同义突变SNP/基因与抗枯萎病/抗不育花叶病的相关性

  对于抗枯萎病基因：对三个抗病(ICPL99050，ICPL20097，ICP8863)和一个感病材料(ICPB2049)的重测序结果进行比对。对于抗不育花叶病基因：对三个抗病(ICPL99050, ICPL 20097 ，ICPB 2049) 和一个感病材料(ICP 8863) 的重测序结果进行比对。然后分别确定两种病的候选基因。

  7，候选基因的功能注释及qRT-PCR验证

  注释到两个有毒害的基因，且在抗感材料中是差异表达的。

  A，抗不育花叶病基因C.cajan_01839的蛋白结构。B，生物信息学分析蛋白结构引起的毒害效果。

  A，抗枯萎病基因C.cajan_03203的蛋白结构。B，生物信息学分析蛋白结构引起的毒害效果。

  研究亮点  

  1、利用一个包含188个株系的木豆F7 RIL群体同时对抗枯萎病和抗不育花叶病基因进行的定位。以ΔSNP index=-1以及非同义突变SNPs为条件，共找到7个候选基因的8个SNP位点。  

  2、针对候选SNP位点进行共分离假设的卡方检验，排除了其他与候选SNPs共分离的可能。 

  3、同时对其他的抗、感材料进行基因组重测序，将7个候选基因分别属于哪种抗病基因进行了区分，同时结合对候选基因的功能注释（估计毒害效果）以及qRT-PCR的验证，将两个病害的抗病候选基因分别锁定为C.cajan_03203和C.cajan_01839。

  参考文献  

  next-generation sequencing for identification of candidate genes for fusarium wilt and sterility mosaic disease in pigeonpea (cajanus cajan)[J]. Plant Biotechnol J. IF=6.09