水稻和褐飞虱之间相互作用的比较代谢组学

  摘要：  

  介绍 植物和食草昆虫之间的相互作用是复杂和多面的。水稻及其害虫褐飞虱（BPH），褐飞虱属（半翅目：飞虱科）构成了研究植物-昆虫相互作用的理想系统。 

  目标 进行水稻和BPH的比较代谢组学分析，以了解宿主水稻防御机制和对BPH昆虫响应。  

  方法 使用GC-MS方法研究水稻叶鞘和BPH蜜露中的代谢物动力学。通过PCA分析和偏最小二乘判别分析来分析GC-MS数据。  

  结果 在叶鞘提取物中检测到26种代谢物。水稻叶鞘代谢组学分析结果表明，BPH喂养诱导YHY15和TN1植物中代谢物轮廓的显着变化。这些结果表明BPH侵染增强了TN1植物中的脂肪酸氧化，乙醛酸循环，糖异生和GABA分流途径，以及YHY15植物中的糖酵解和莽草酸途径。我们推测BPH15基因介导防御反应，通过莽草酸途径增加次级代谢产物的合成。在BPH蜜露中鉴定出33种代谢物。蜜露代谢组学分析结果表明，与BPH喂养TN1植物相比，当BPH昆虫以YHY15抗性植物为食时，蜜露中的大多数氨基酸水平显着降低。基于代谢组学结果，我们预测BPH饲喂YHY15抗性植物将增强氨基酸的吸收，同时尿素显着增加。  

  结论 代谢组学研究对于理解植物和食草昆虫动物之间复杂和多方面的相互作用是有效的，并提供了控制BPH发展新策略的必要线索。

  材料方法

  植物材料与昆虫  

  TN1是没有抗性基因的易感水稻品种。选择定位来自TN1 9 RI93（携带单个BPH15抗性基因而选择的RIL）的群体通过标记辅助选育含有BPH抗性基因BPH15的抗性水稻品系YHY15，并且BPH15匹配到4号染色体的短臂上（Yang等人2004）。BPH生物型Y和1是完全同胞交配至少40代，并分别依靠YHY15和TN1水稻植物供养。生物型Y是通过迫使生物型1进食YHY15水稻而获得的新实验生物型（Jing et al。2012）。在水稻叶鞘代谢组学分析中使用BPH生物型1侵染水稻，蜜露收集用于蜜露代谢组学分析。BPH生物型Y用于蜜汁收集。用于测试的BPH和水稻植物被饲养和种植在武汉大学遗传学研究所。BPH和水稻在28℃/ 14小时光照（06：00-20：00）和25℃/ 10小时黑暗（20：00-06：00）的温室中在生长，照明和湿度条件确保水稻和BPH良好生长。

  BPH处理  

  将10个发芽良好的水稻种子均匀地播种在每个实验盆（直径10cm，高15cm）中。 使用四叶期水稻幼苗进行实验。TN1和YHY15植物各自分成三组。对于两个品种，一组用作没有BPH侵染的对照，其他两组分别用BPH生物型1处理24和48小时。在本研究中使用了30个TN1和YHY15水稻叶鞘样品，每个样品含有5株植物混池，每个处理含有5个生物学重复。将15只3-4龄BPH幼虫引入处理组的每个植物，并在实验结束前0, 24和48小时用纱布覆盖。处理后，将最外层叶鞘快速剥离并置于液氮中用于随后的分析。

  BPH蜜露收集  

  将保鲜膜M切割并折叠以形成长3cm，宽5cm的袋。然后将这些袋固定在稻秧离土壤上2cm处的茎上，留下小开口以允许放置BPH。将五个相似大小的五龄雌性BPH放置在每个袋中，然后密封。BPH在TN1或YHY15上饲养24小时后，移除袋并用微量吸液管收集所有蜜汁，然后转移到离心管中并保持在冰上。每袋作为一个生物学重复，对于用TN1或YHY15处理的每个生物型都有六个生物学重复。在本研究中总共有24个收集的蜜汁样品。

  BPH重量变化和蜜汁分泌物的评估  

  为了量化蜜露的量，如上所述收集BPH蜜露，除了一个袋子包含一个新的短翅雌性并在48小时后收集蜜露。使用微量天平测量甘露重量。  

  为了量化BPH体重的变化，选择新的短翅雌性并使用微量天平测量。然后将昆虫放在4周龄的YHY15或TN1植物上。72小时后，每个个体再次称重。BPH重量增加计算为相对于初始重量的比例变化。每次处理的蜜汁排泄物和体重实验各15次重复。

  代谢物提取和衍生化 

  根据Lisec等人报道的方案制备叶鞘提取物（2006）。简言之，将100mg叶鞘叶片样品研磨成粉末，并用1400mL甲醇（预冷却至-20℃）和60uL核糖醇（0.2mg / mL水溶液）作为内标提取。提取后，将样品在混匀仪中振荡10分钟，并在11,000g下离心10分钟。将上清液转移到1.5mL离心管中，然后与750μL氯仿（-20℃）和1400uL预冷却的双蒸水（-20℃）剧烈混匀，涡旋10s并在2200g下离心10min 。然后将150μL（极性相）上清液转移到另一个干净的1.5mL管中，真空下干燥。  

  通过在10,000g下离心5分钟获得蜜露的上清液。将10μL上清液用于GC-MS检测，使用1uL核糖醇（0.2mg / mL水溶液）作为内标，然后用氮气流干燥，为下一步衍生化作准备。将干燥的残余物再溶解于40uL甲氧基化试剂（甲氧基-氨基-盐酸盐，20mg / mL吡啶溶液）中并在37℃下在70uLMSTFA中衍生化30分钟。然后将衍生的样品转移至适合于GC-MS分析的管中。

  气相色谱分析条件  

  在具有Rtx-5MS毛细管柱（30m×9×0.25mm）的GC-MS（Thermo Trace GC Ultra-ISQ质谱仪，Thermo Fisher Scientific，USA）上分析衍生化的样品。使用氦气作为载气，流速为1mL / min; 柱初始烘箱温度在100℃保持3分钟，以5℃/分钟升至280℃，然后保持5分钟。使用AS-3000自动进样器将样品保持在1uL，并设置为进行不分流进样; 注射温度保持在250℃。使用三-（全氟丁基）-胺（CF43）根据说明书调节质谱仪。70eV电子轰击模式用于电离，记录的质量范围为50-650m/z。

  GC–MS 数据分析  

  忽略信噪比（S / N）低于30的峰以避免假阳性。此外，借助于与样品一起制备和分析的对照样品，排除人为误差峰。通过从NIST文库中搜索NIST MS Search 2.0软件来鉴定化合物。我们选择了与数据库匹配超过70％的目标化合物。我们还通过将它们的质谱和保留时间与相应标准品比较来鉴定化合物（表S1，S2，S3）。此外，选择三个质量作为限定离子以帮助识别化合物（表S1，S2）。通过使用Xcalibur软件的自动积分和手动校正功能，将所确定的目标化合物的峰面积自动积分。通过核糖醇内标进行归一化，测定各化合物的相对峰面积。然后我们使用校正的保留时间，样品信息和相对峰面积来产生三维模型。

  统计分析

  然后将代谢物的三维模型信息输入SIMCA-P软件。在执行主成分分析（PCA）之前，用单位方差缩放对数据文件进行缩放。应用SIMCA-P进行PCA以及进一步PLS-DA分析。MeV-4-6-0用于绘制热图，并进行层次聚类分析。使用SPSS17.0软件进行T检验和ANOVA分析。

  结论

  Fig. 1（a）BPH蜜露分泌量的平均值;（b）BPH重量增加变化量的平均值（±SD）。 每次处理的分泌蜜汁和体重实验各重复15次（n = 15）。 B1T：生物型1 BPH喂养TN1，B1Y：生物型1喂养YHY15，BYT：生物型Y喂养TN1，BYY：生物型Y喂养YHY15。 条形图上的不同字母表示通过Tukey检验的处理之间的显着差异：p< 0.01为大写字母，或p< 0.05为小写字母。

  表1 通过GC-MS测量水稻叶鞘样品代谢物的相对峰面积（平均值±SEM）和由BPH侵染诱导的代谢物变化

  与对照组相比显着增加（t检验，p<0.05）; 与对照相比显着降低（t检验，p<0.05）T0h：TN1对照无BPH侵染，T24h：TN1受BPH侵染24小时，T48h ：TN1受BPH侵染48小时，Y0H：YHY15对照无BPH侵染，Y24h： YHY15受BPH侵染24小时，Y48h：YHY15受BPH侵染48小时

  表2 通过GC-MS测量BPH蜜露代谢物的相对峰面积（平均值±SEM）以及当喂养TN1和YHY1时生物型1和Y代谢物的代谢变化

  与对照组相比显着增加（t检验，p<0.05）; 与对照相比显着降低（t检验，p<0.05）

  B1T:用TN1喂养的生物型1 BPH（对照生物型1）；B1Y：用YHY15喂养的生物型1BPH；

  BYT：用TN1喂养的生物Y BPH（对照生物型Y）；BYY：用YHY15喂养的生物型Y BPH。

  图2 水稻叶鞘和蜜汁代谢物的PCA得分图。

  A：BPH侵染0h（对照），24小时和48小时的TN1和YHY15的水稻叶鞘代谢物的PCA得分图。正方形：TN1植物具有BPH处理0小时，实心圆：TN1植物具有BPH处理24小时，实心菱形：TN1植物具有BPH处理48小时，向上三角形：YHY15植物具有BPH处理0小时，向下三角形：YHY15植物具有BPH处理24小时，星号：YHY15植物具有BPH处理48小时。 

  B: 用TN1和YHY15喂养生物型1和Y后蜜汁中的PCA得分图。 正方形：用TN1喂养生物型1，实心圆：用YHY15喂养生物型1，菱形：用TN1喂养生物型Y，向上三角形：用YHY15喂养生物型Y。 

  图2a显示T24h和T48h明显区别于Y24h和48h，而在T0h和Y0h之间没有明显区别。这些结果表明，TN1和YHY15之间代谢物变化的差异主要是由BPH喂养而不是两个品种之间的遗传背景差异引起的。抗性基因可能通过独特的抗性机制响应BPH侵染的。 

  图2b： 24个样品根据不同的生物型和它们在不同水稻植株上的摄食而清楚地分成四组。

  图3. 水稻叶鞘和蜜汁代谢物的PLS-DA得分图。

  A：BPH处理TN1叶鞘0小时（对照），24小时和48小时的代谢轮廓获得的TN1 PLS-DA得分图。正方形：TN1植物具有BPH处理0小时，实心圆：TN1植物具有BPH处理24小时，实心菱形：TN1植物具有BPH处理48小时。B: TN1 PLS-DA载荷图。  

  C:BPH处理YHY15叶鞘0小时（对照），24小时和48小时的代谢轮廓获得的TN1 PLS-DA得分图。向上三角形：YHY15植物具有BPH处理0小时，向下三角形：YHY15植物具有BPH处理24小时，星号：YHY15植物具有BPH处理48小时。 D: YHY15 PLS-DA载荷图。  

  E: 用TN1和YHY15喂养生物型1后蜜汁中代谢的PLS-DA得分图，正方形：用TN1喂养生物型1，实心圆：用YHY15喂养生物型1。F: 生物型1 的PLS-DA载荷图。  

  G: 用TN1和YHY15喂养生物型Y后蜜汁中代谢的PLS-DA得分图，菱形：用TN1喂养生物型Y，向上三角形：用YHY15喂养生物型Y。H: 生物型Y PLS-DA载荷图。 

  为了进一步了解叶鞘代谢物受BPH处理影响，我们进行PLS-DA分析表明各种处理之间差异明显。图3A：在TN1中，结果显示模型具有良好的质量，每组显着区分。三个不同的BPH处理周期明显区分。在PLS1维度中T0h和T48h之间的差异最明显。在PLS2维度中T0h和T24h之间分离最显着。图3B ：PLSDA载荷图显示了代谢物对分离度的可变影响。图3C：对于YHY15每组之间显着区分。在PLS2维度上Y0h与Y24h和Y48h明显分离，而在PLS1维度上Y24h和Y48h明显分离。图3D：PLS-DA载荷图显示了代谢物对分离度的可变影响。结合PLS-DA模型的VIP值和t检验，如果t检验得到p<0.05，我们筛选出与对照组相比显着变化的代谢物。图3E：对于生物型1，在PLS1维度中B1T和B1Y区分显着。图3G：对于生物型Y，在PLS1维度中BYT和BYY区分显着。图3F,H中显示结合VIP值和t检验筛选出的生物型1和Y中不同代谢物。

  图4 BPH喂养诱导的TN1和YHY15代谢途径的变化

  T24 versus T0表示用BPH处理24小时和0小时（对照）的TN1之间的比较，T48 versus T0表示用BPH处理48小时和0小时（对照）TN1之间的比较，Y24versus Y0表示用BPH处理24小时和0小时（对照）的YHY15之间的比较，Y48 versus Y0表示用BPH处理48小时和0小时（对照）的YHY15之间的比较。

  红色符号表示显着增加（p<0.05），黑色符号表示无显着变化（p<0.05），绿色符号表示显着降低（p<0.05）  

  图4结果预测BPH侵染YHY15促进b-氧化和糖酵解途径。同时，莽草酸水平在处理24和48小时内稳定增加。表明YHY15对BPH的抗性可以通过莽草酸合成来调控。  

  BPH侵染TN1结果表明GABA水平显着增加，并伴有谷氨酸和α-酮戊二酸水平的升高。推测BPH侵染TN1增强了GABA分流途径。并且24h和48h样品中的SA含量高于对照组（0h），这表明BPH侵染TN1也增强了SA介导的防御。对TN1用BPH处理24和48小时导致TCA中间体如苹果酸，甘油酸和琥珀酸的增加。我们推测脂肪酸通过b-氧化产生乙酰辅酶A，这些乙酰辅酶A通过乙醛酸循环代谢产生琥珀酸和苹果酸，然后将琥珀酸和苹果酸转化为草酰乙酸，其通过TCA循环进入糖异生途径以形成葡萄糖。同时，脂肪酸的b-氧化可以提供ATP用于糖异生。因此我们推测BPH喂养促进b-氧化，并且该b-氧化引起棕榈酸含量降低。Bolton等人已经证明几种病原体侵染导致脂肪酸氧化途径上调.

  亮点  

  1. 选取了水稻及其害虫褐飞虱进行水稻和BPH的比较代谢组学分析，研究植物-昆虫相互作用。  

  2.研究BPH侵染水稻后，YHY15和TN1植物中代谢通路变化。

  参考文献：  

  Comparative metabolomics of the interaction between rice and the brown planthopper  

  Metabolomics (2016) IF=3.661