全基因组de novo测序结合RNA-Seq，揭示淀粉分解酵母及其种间杂种独特的基因组和生理特征

  对具有水解活性的真菌物种的基因组研究已经获得了越来越多的关注，因为它们对基于生物质的生物燃料的生产具有巨大的生物技术潜力。淀粉分解酵母Saccharomycopsis fibuligera是糖化时涉及的酶和基因的良好来源。尽管其在食品发酵和生物乙醇生产中的历史悠久，对其基本的生理学和基因组特征知之甚少。

  结果：  

  对S. fibuligera KJJ81和KPH12（韩国小麦Nuruk的两个分离株）进行了全基因组de novo测序和组装。KJJ81基因组（?38Mb）被鉴定为KPH12基因组（?18Mb）与另一个与KPH12基因组具有88.6％核苷酸一致性的未鉴定的基因组之间的杂交体。KJJ81亚基因组的七个染色体对显示高度保守的共线性，表明杂交事件是最近发生的。系统发生学显示，S.figuligera在酵母菌亚门的酵母菌分支前就有分支。在S.fibuligera基因组中缺乏硫酸同化基因，反映了酵母菌进化枝作为天然硫营养缺陷型的独特表型。还鉴定了扩展的基因家族，包括涉及糖化和蛋白水解的新基因。此外，与德国黑麦面包的分离菌S.fibuligera ATCC 36309的比较基因组分析揭示，在KJJ81杂交基因组产生之前，KPH12基因组中已发生染色体间易位。

  结论：  

  高质量注释的从头测序的S. fibuligera基因组和RNA-Seq分析，有助于推测S. fibuligera在发酵物降解中的功能。基因库存便于发现适用于生产新型有价值的酶和化学品的新基因。此外，作为酵母属中的第一个零gap基因组组装，S. fibuligera及其种间杂种的独特基因组特征有助于深入研究真菌基因组的进化适应。

  材料与方法：  

  材料：淀粉分解酵母Saccharomycopsis fibuligera KJJ81和KPH12，ATCC 36309。  

  取材方法：从韩国小麦Nuruk的两个分离株Jeju(KJJ81)和Pohang (KPH12)分离得到。从德国黑麦面包分离得到ATCC 36309。  

  测序策略和分析流程：  

  测序：基因组：PacBio RS II, TruSeq Synthetic Long Reads, Illumina HiSeq 2500；分别产生long, short, and long-mated pair reads. 

  转录组：Illumina HiSeq 2500, PE 100bp  

  分析：基因组组装质量评估：QUAST；  

  比对到KPH12和KJJ81基因组：STAR spliced read aligner； 

  获得与蛋白质编码基因比对的reads片段的总计数：HTSeq； 

  差异表达分析：TCC package；  

  RNA-seq比对：TopHat； 

  蛋白序列比对：Exonerate；  

  搜索KPH12和KJJ81之间的同源基因：TBLASTN； 

  通过de novo预测来鉴定缺失的基因：MCScanX；  

  功能注释：BLASTP；  

  搜索蛋白质结构域：InterProScan； 

  筛选重复DNA序列：RepeatMasker；

  结果：

  1、 淀粉分离酵母KJJ81和KPH12的形态和基因组结构  

  A、KPH12和KJJ81的丝状生长以及在YPD平板上培养的少部分芽殖酵母细胞。KJJ81和KPH12仅以少量萌芽酵母细胞的形式生长成絮状，KJJ81的菌丝似乎比KPH12的菌丝厚。  

  B、KPH12（左）和KJJ81（右）的基因组结构图，标注了序列覆盖情况。光学测绘数据显示在指定为染色体1的最大scaffold中存在?0.5Mb的一个大缺失区（染色体1-7按大小排列，从?4.9到?1.3Mb逐渐减小）。基于缺失区域的大小和单个rDNA单元（9314bp）的大小估计，染色体1上的缺口区域被鉴定为具有约50个拷贝的rDNA重复基因座。结果表明KPH12基因组的7个scaffold在染色体水平上正确组装（图1b，左）。  

  KPH12和KJJ81基因组序列的比较分析显示，两个KJJ81同源scaffolds与KPH12假染色体的共线性（图1b，左）。将KJJ81的14个scaffolds分成两个亚基因组，基于两个基因组之间的序列相似性，命名为A（KPH12和A之间的平均相似性为99.1％；共19.7Mb）和B（KPH12和B之间的平均相似性为88.6％；共18.8Mb）。KJJ81的两个亚基因组之间的相似性为89％。结果表明，KJJ81是包含通过KPH12的祖先与另一个与KPH12基因组具有88.6％核苷酸一致性的未鉴定的亚种杂交产生的七个染色体对的适应物种。

  C、KPH12和KJJ81基因组序列之间的线性分析。使用SyMAP产生两个基因组的WG点图。 红色框表示染色体间易位，绿色框表示缺失。KJJ81杂合基因组的亚基因组A和B中的七个染色体对完全保留了保守的合子，除了染色体3和5之间的染色体间易位以及染色体1上的rDNA簇的缺失。  

  D、淀粉分离酵母基因组中rDNA的重复结构。ETS1,5'-ETS（外转录间隔物）；ETS2,3'-ETS；NTS，未转录间隔物；ITS，内转录间隔区；FRA1，编码假定的Xaa-Pro氨基肽酶的ORF；TNT1-94，与来自烟草转座子的逆转录病毒相关的Pol多蛋白基因同源的ORF；PLB1，编码溶血磷脂酶1的ORF。  

  rRNA的排列与酿酒酵母中相似。单个单元由两个转录区域（35S前体rRNA和5S rRNA的编码区域）和两个非转录间隔区（NTS1、NTS2）组成。KPH12基因组和KJJ81亚基因组A都具有染色体1上约50个拷贝的9314bp的重复单元组成的rDNA基因座（图1d，上图）。KJJ81亚基因组B显示rDNA簇的缺失，仅留下9288bp的单拷贝rDNA单位（图1d，下图）。

  2、 S.fbuligera KPH12和KJJ81基因组组装和注释结果  

  最终组装的KPH12和KJJ81基因组由7和14个线性scaffolds组成，N50分别为1.9和3 Mb，总长度分别为19.7和38.6 Mb。平均测序深度分别为98.3×和51×，基因组覆盖率≥99.97％，表明组装的高精度。  

  预测在KPH12基因组中6155个蛋白编码基因，平均长度为1.7kb，平均外显子长度为1.4kb，每个基因平均有1.2个外显子。KJJ81基因组预测有12,135个蛋白质编码基因，组分类似。

  3、 S.fbuligera基因组在子囊菌门中的系统发生和进化分析 

  A、基于基因组序列的KPH12和KJJ81的系统发育树分析。使用MEGA6与子囊菌门的其他成员构建系统发育树，主要由三个亚门组成，即疫霉菌门（Pezizzomycotina），酵母菌门（Saccharomycotina）和外囊菌门（Taphrinomycotina）组成。WGD全基因组重复事件发生在酵母菌门祖先种。 

  B、子囊菌门真菌中蛋白家族的扩增和收缩，使用Pfam蛋白家族数据库进行分析。在真菌基因组中共有的和独特的蛋白质家族与真菌种类的历史和生活方式相关。在S.fbuligera基因组中，涉及蛋白质降解的冗余基因家族，例如真核天冬氨酰蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶家族和肽酶抑制剂I9，存在显着的过表达。

  4、 S.fbuligera碳代谢途径的重建  

  A、基于注释的基因组信息重建的碳代谢途径。糖代谢为大多数生物体提供了能量和代谢物的重要来源。利用S.fbuligera完整的基因组序列，鉴定参与葡萄糖同化的基因，包括糖酵解、乙醛酸、磷酸戊糖途径、三羧酸循环（TCA）和乙醇生产。 

  B、低葡萄糖条件下C-代谢途径的基因表达谱。D0.1，含0.1％葡萄糖的YPD；D2，含2％葡萄糖的YPD。括号中的数字表示旁系同源物的数目。通过RNA-Seq分析在高（2％，D2）和低葡萄糖（0.1％，D0.1）下参与碳代谢的主要基因的转录水平，以红色（诱导）或蓝色（抑制）表示。通过RNA-Seq分析观察到的不同基因表达谱反映，S.fbuligera分离株KJJ81和KPH12具有不同的葡萄糖消耗和乙醇发酵的能力。

  5、 S.fbuligera硫代谢途径的重建  

  A、基于注释的基因组信息重建的硫代谢途径。  

  B、硫限制条件下S-代谢途径的基因表达谱。B，含2％葡萄糖的B培养基；D2，含2％葡萄糖的YPD。括号中的数字表示旁系同源物的数目。通过RNA-Seq分析在硫限制性B培养基和YPD培养基中参与碳代谢的主要基因的转录水平，以红色（诱导）或蓝色（抑制）表示。编码甲硫氨酸转运蛋白的基因（S16、17）、半胱氨酸到甲硫氨酸途径（S7、8）和OAH途径（S1、2、3），在硫限制性B培养基上明显活化。而从同型半胱氨酸生物合成半胱氨酸的转硫途径（S6、9）在硫限制条件下显着降低。结果暗示S.fbuligera中存在调节系统将硫同化途径转向甲硫氨酸的生物合成。

  6、 S.fbuligera中与纤维素、淀粉、细胞壁降解相关基因的表达谱 

  与纤维素（a）、淀粉（b）、细胞壁降解（c）相关的KJJ81和KPH12基因表达谱。D2，含2％葡萄糖的YP；D0.1，含有0.1％葡萄糖的YP；B，B培养基。 括号中的数字表示旁系同源物的数目。  

  S.fbuligera基因组的分析显示该酵母保留了几种在大多数纤维素分解真菌中发现的编码水解酶的基因。  

  在KJJ81和KPH12基因组中仅发现了一个编码可分泌α-淀粉酶（ALP1）的基因，其推导序列先前被报道与来自米曲霉的α-淀粉酶高度同源。 

  有多个基因，注解为涉及细胞壁维持和胞质分裂的葡聚糖1,3-β-葡糖苷酶，内切-1,3（4）-β-葡聚糖酶，1,3-β-葡聚糖酶/转葡萄糖苷酶和分泌的β-葡糖苷酶。

  7、 淀粉分解酵母S.fbuligera中假定的蛋白酶基因的分析  

  A、米曲霉、酿酒酵母和淀粉分解酵母KPH12的假定蛋白酶家族的饼图。蛋白水解酶家族根据肽酶数据库MEROPS分组。A天冬氨酸，C半胱氨酸，G谷氨酸，M金属蛋白酶，N天冬酰胺，P混合，S丝氨酸，T苏氨酸，U未知蛋白酶。显示了每个家族的基因数量。S.fbuligera特异地富集了天冬氨酸蛋白酶家族基因。  

  B、KJJ81亚基因组中分泌性蛋白酶的系统发育树。酿酒酵母和带有GPI（糖基磷脂酰肌醇） motif的假定的淀粉分解酵母显示为绿色。进化树还包括米曲霉酸性蛋白酶、酿酒酵母液泡酸性蛋白酶PEP4、酿酒酵母蛋白酶。  

  C、编码分泌的酸性蛋白酶的S.fbuligera基因的转录分析。D2，含2％葡萄糖的YP；D0.1，含有0.1％葡萄糖的YP；B，B培养基。一些PEP1家族成员的表达在低葡萄糖和硫限制条件下较高。

  8、 ATCC 36309、KPH12、KJJ81基因组的比较分析

  A、两两基因组序列之间的线性分析。红色框表示染色体间易位，绿色框表示缺失。 

  B、用SynChro通过绘制染色体，将观察到两个基因组序列之间的线性blocks可视化。  

  C、两个S.fbuligera亚种分别与亚基因组A和B杂交。通过各种遗传改变将两个亚种与S.fbuligera的最后一个共同祖先分离。在亚基因组A谱系中，S.fbuligera KPH12和S.fbuligera ATCC 36309分离，具有额外的遗传改变，例如BGL2的缺失、染色体3和5之间的相互易位。KPH12和亚基因组B的亲本的杂交种，伴随着亚基因组B中的rDNA簇的丢失，产生携带七对染色体的S.fbuligera KJJ81杂种。在杂交事件后可能发生亚基因组B谱系中一些非必需基因的丢失。

  亮点分析：

  1、对淀粉分解酵母进行了完整的高质量注释的基因组测序和RNA-Seq分析。为S.fbuligera在发酵物降解中的功能推断建立了重要的基础。  

  2、基于S.fbuligera的新的遗传操作平台，可用于糖化/发酵过程的工程化酵母菌株的开发，以及改进子菌株，适于生产具有期望的香味特征的米酒或改善的营养组合物。  

  3、获得用于S.fbuligera及其种间杂种菌株的基因组信息，为比较生物信息分析提供了重要的基础，并记录真菌群体的进化分支。

  参考文献： 

  Whole-genome de novo sequencing, combined with RNA-Seq analysis, reveals unique genome and physiological features of the amylolytic yeast Saccharomycopsis fbuligera and its interspecies hybrid.  

  Biotechnology for Biofuels-2016，IF=6.444