血清和肌肉代谢组学用于预测终极pH，鸡肉质量的关键因素

  摘要： 

  肌糖原储存的变化与肉的极限pH（pHu）的变化高度相关，pH变化是家禽肉质量的关键因素。在胸部pHu上分散地选择两条鸡遗传系来理解鸡肉品质变化的生物学基础（即以肌肉糖原含量17％的差异为特征的pHu -和pHu +遗传系）。通过高分辨NMR（1H和31P）定量肌肉代谢物，1 H NMR定量血清代谢物，研究了该选择对鸡代谢的影响。通过在血清和肌肉中的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分别鉴定两个品系之间的总共20和26个差异代谢物。在pHu-遗传系的血清和肌肉中存在碳水化合物代谢物的过度表达，与其高水平的肌糖原一致。然而，pHu +遗传系具有氧化应激和肌肉分解代谢的标志物的特征，可能是因为其低水平的能量基质。在OPLS-DA多模块分析之后，鉴定了15个高置信度生物标志物的代谢物，其可用于在独立群体中进行验证后预测家禽肉的质量。

  实验部分  

  用于选择鸡胸部极限pH的两个分散品种（程序no.00880.02）所需的所有动物培养和实验程序由Val de Loire（由国家委员会第19号文件注册）的动物实验伦理委员会批准。除特别说明，所有化学药品均购自Sigma-Aldrich（Saint-Quentin Fallavier，法国）。

  鸡和样品收集 

  这项研究是对来源于高pHu（pHu +）或低pHu（pHu-）胸大肌（P. major）肌肉值分散选择的两个遗传系的第六代鸡进行的。它们来自商业生长快速遗传系，其生长身体特征与肉类工业上目前使用的商业杂交种非常相似。在6周龄时，在PEAT实验单位（INRA，Centre Val de Loire，Nouzilly，France）饲养和屠宰。肉鸡自由摄食和喝水直至屠宰前8小时。在出血期间从每个遗传系选择150只鸡收集血液样品，并在室温下保持15分钟直到凝固。离心（4000g，10分钟）后，将血清等分并保存在-80℃直至进一步分析。在屠宰后15分钟，收集胸大肌（P. major）样品，立即在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直到分析。在宰杀后一天，使用便携式pH计（506型，Crison Instruments SA，Barcelona，Spain）通过将玻璃电极直接插入肌肉的最厚部分中来测量胸大肌的pHu。选择总共20个pHu +和19个pHu-雄性肉鸡，由于它们极端的胸肌pHu值被选择用于代谢组学实验。

  肌肉糖酵解能力和肉质量的测定  

  如Dalrymple和Hamm（1973）中所述，将约500mg冷冻的胸大肌样品在死后15分钟取样磨成粉末并用于测量糖原和乳酸盐浓度。糖原和乳酸盐浓度用于计算肌肉糖酵解能力根据以下公式：糖酵解能力（μmol/ g等量乳酸盐）=（2×[糖原]）+ [乳酸盐]。  

  通过测量几个参数（包括pHu，亮度，水分流失，烹饪后的韧性和处理后产量）来评估胸肌肉的质量。

  NMR样品制备  

  通过冷甲醇沉淀脂质和蛋白质制备来自39个选择的鸡血清用于1 H NMR。与脂质和蛋白质信号抑制后记录的完整血清光谱相比，这种制备方法稍微改善了光谱的质量。将未冷冻的血清样品在4℃以15000g离心10分钟。随后将500μL上清液与1mL甲醇混合，在-20℃下冷却20分钟。然后将混合物进行离心，并在室温下玻璃管中收集1200μL上清液在SpeedVac（ThermoScientific，Villebon sur Yvette，France）中进一步蒸发，并保存在-20℃中。提取的胸大肌代谢物根据Wu文献中Folch型两步法：使用1:1:0.7比例的甲醇，氯仿和水。肌肉样品用液氮冷却后研磨。将冷冻肌肉粉（200mg）转移到具有钢珠的离心管中，然后加入800μL冷甲醇和170μL冷Milli-Q水（Millipore S.A.S.，Molsheim，France）混合。将混合物用Retsch MM301匀浆器（Retsch，Haan，Germany）在30Hz下匀浆化2分钟，转移至Pyrex管，加入800μL氯仿和400μL冷水后振荡1分钟，然后放置在冰上10分钟。最后将混合物离心（2000g，5分钟，4℃）来分离之前在-20℃下储存的SpeedVac中蒸发的极性相。

  NMR谱测定 

  在NMR分析之前，将提取的39个血清样品在含有99％氧化氘（D2O）的575μL 0.2M磷酸钾缓冲液中重新溶解。重新溶解的血清样品的pH为7.4±0.5。将提取的39个肌肉样品溶解在500μL99％的D2O中。将25或30μL的3-三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）的样品分别加入血清或肌肉样品中作为内参。然后将混合物短暂涡旋并在4℃下以4000g离心15分钟以除去不溶性组分。将所得上清液转移至常规5mmNMR管（CortecNet，Paris，France）用于NMR分析。

  统计分析  

  所有单变量统计用R 3.1.2计算。 

  肉品质参数T检验 使用Welch's T检验在95％置信区间的质量性状检验pHu-（n = 19）和pHu +（n = 20）样品之间的平均值，两组样本之间的方差不等。 在±标记后给出每个平均值的标准偏差。  

  多变量分析 使用SIMCA13软件（版本13.0，Umetrics，Ume?，Sweden）对三个数据集（即血清1HNMR和肌肉1HNMR和31PNMR）进行正交投影潜在结构判别分析（OPLS-DA）。将所有数据缩放至单位方差以最大化pHu+和pHu-遗传系之间的分离度。OPLS-DA是一种分类的方法，通过解释定量的变量（通过光谱或代谢物定义）来预测分类因子。光谱数据X的变量分为包含与类别标志Y（pHu+或pHu-遗传系）相关变量的一个预测成分和含有与预测成分正交变化的单个或多个正交分量。它不帮助区分定义的群组。通过分离预测和非预测组分，我们发现OPLS-DA比PLS-DA更适合于预测通常包含可能与预测变量不相关的多个来源的生物学变量 

  通过累积的R2Y（定义为由模型预测成分解释的Y中的方差比例和累积的Q2）分析的三个数据集的模型的总体质量。通过SIMCA13软件的交叉验证缺省方法（7倍交叉验证）获得模型的类别预测能力：R2Y（cum）和Q2（cum）越高，遗传系之间的分离度越好。应用交叉验证方差分析（CV-ANOVA）来进一步评估发现物的显着性。为了提高筛选能力，我们确定了三种OPLS-DA模型（血清1HNMR，肌肉1HNMR和31PNMR）的最佳分类所需光谱特征的最小值，通过迭代地从模型中排除具有低回归系数和高标准偏差的变量以及低VIP（可变重要性投影），通过最大化Q2和R2Y（cum）评估获得预测成分。模型中VIP>1的代谢物被认为是重要的。变量贡献点图还可以评估模型中的每个预测因子的贡献值。

  为了鉴定三个数据组中最相关的代谢物，我们通过多模块OPLS-DA应用于之前由血清1HNMR，肌肉1HNMR和31PNMR的OPLS-DA鉴定的光谱中的替代模型，并且在三个模块中结构化。在实践中，将不同的模块分配给每个数据集的变量，并且缩放每个模块以避免一个模块对于其他模块的控制。然后迭代地对三个模块进行OPLS-DA分析，从模型中排除最不相关的变量。将多模块模型的结果与每个数据集分别分析的三个模型结果进行比较。

  代谢物数量T检验 在OPLS-DA分析之后，使用Welch's T检验（方差不等）在95％置信区间检验每种判别代谢物的两条鸡遗传系之间的平均值。

  代谢物组富集分析  

  为了鉴定最显着影响的代谢途径，我们通过代谢物集富集分析（MSEA），衍生于基因集富集分析（GSEA）方法，分析每个遗传系的差异代谢物标志，并应用基于网页的代谢组学分析软件Metaboanalyst（MetaboAnalyst 3.0，http：//www.metaboanalyst.ca）进行分析。根据它们对pHu +或pHu-遗传系的贡献，将血清和肌肉的OPLS-DA差异代谢物分成两个列表。每组代谢物的代谢物富集分析使用提供的“通路相关代谢组”的过表达分析（ORA）进行，包括基于正常代谢途径的88个代谢物组。使用超几何测试应用ORA以评估特定代谢物组在给定化合物列表中是否比预期更高表达。选择截止P值为0.1以保留最显着富集的代谢途径。

  结果  

  表1：pHu-（n = 19）和pHu +（n = 20）两个遗传系的主要肌肉特征

  在六代选择后， pHu +和pHu-遗传系群体的平均pHu值分别为6.13±0.11和5.65±0.09（n = 150，P≤0.0001）。 选择用于代谢组学分析的雄性肉鸡组群显示出更极端的胸大肌pHu值（表1）。

  死亡后15分钟的糖酵解能力和肉质量性状存在广泛差异，与pHu?遗传系相比，pHu +遗传系中胸大肌糖原含量减少25％，并且肉色更黑，渗出性减少，肉质更嫩以及更高的加工产量（表1）。胸大肌pHu与胸大肌糖酵解能力呈现高度负相关（r = -0.90，P≤0.0001）。结果发现在pHu +（56.7±11.0μmol/ g）和pHu-（60.6±12.0μmol/ g）遗传系之间死后15分钟胸大肌中乳酸盐含量在统计学上没有显着差异。

  图1.（A）肌肉提取物1 H NMR的OPLS-DA的代谢组得分图 （B）肌肉提取物31P NMR的OPLS-DA的代谢组得分图（C）血清提取物1 H NMR的OPLS-DA的代谢组得分图

  注：pHu-和pHu +遗传系的个体分别由红色三角形和蓝色圆圈表示。 模型的描述性和预测性能特征为：肌肉1H NMR的R2Y（cum）= 0.81和Q2（cum）= 0.76; 肌肉31 P NMR的R2Y（cum）= 0.63，Q2（cum）= 0.45;血清1H NMR的R2Y（cum）= 0.82，Q2（cum）= 0.61。

  分别对1H NMR光谱数据和31 P NMR光谱数据进行OPLS-DA分析。第一模型（1H NMR）产生具有交叉验证的预测能力Q2(cum) = 0.76的一个预测和一个正交分量，并且由模型R2Y（cum）解释的Y变化的整体比例 = 0.81。 该模型的可靠性由CV-ANOVA评估，其P值为3.21×10-10。 第二个模型（31P NMR）也产生一个预测和一个正交分量。预测能力为Q2 = 0.45，由模型R2Y（cum）解释的Y变化的总比例= 0.63。 第二个模型的CV-ANOVA给出的P值为4.95×10-4。1 H NMR光谱数据的OPLS-DA和31 P NMR光谱数据的OPLS-DA得分散点图分别显示在图1的图a和b中。

  1H和31P NMR OPLS-DA模型显示pHu +（蓝色）和pHu-（红色）遗传系之间显着分离，表明胸大肌pHu的选择导致胸大肌代谢物特征显着变化。模型的预测质量Q2（cum）对于1H NMR分析很高，对于肌肉31P NMR较低。

  血清1HNMR OPLS-DA显示为一个预测和四个正交分量的预测能力Q2（cum）=0.61的模型，由模型R2Y（cum）=0.82解释的Y方差的总百分比和P值=1.11×10-3，显示两个鸡遗传系之间的显着分离和预测性良好，如散点图1c所示。SIMCA在模型中提出的四个正交分量表明在血清中有许多与肌肉pHu不相关的代谢物。

  表2：通过OPLS-DA鉴定pHu-和pHu +遗传系的差异肌肉代谢物（n = 26）

  注：VIP =在OPLS-DA模型中的变量重要性投影。FC =倍数变化（pHu- / pHu +）。 在pHu +中比在pHu-遗传系中浓度更高的代谢物以粗体显示。Welch表示95％置信水平的相等t检验。

  使用SIMCA软件产生的相应贡献点图来鉴定鸡遗传系间差异的代谢物。通过OPLS-DA鉴定肌肉的差异代谢物，反映它们在OPLS-DA模型中相应的VIP，pHu-和pHu +的倍数变化，及其个体T检验P值列于表2中。

  表3：通过OPLS-DA鉴定pHu-和pHu +遗传系的差异血清代谢物（n = 20）

  注：VIP =在OPLS-DA模型中的变量重要性投影。FC =倍数变化（pHu- / pHu +）。 在pHu +中比在pHu-遗传系中浓度更高的代谢物以粗体显示。Welch表示95％置信水平的相等t检验。

  由OPLS-DA模型鉴定的差异代谢物各自的VIP，pHu-和pHu+倍数变化以及它们的T检验P值列于表3中。值得注意的是，血清差异代谢物主要位于光谱的芳香族区（5.8-8.7ppm）。

  图2.代谢物富集分析由血清和胸大肌（1 H NMR，31P NMR）中的OPLS-DA获得的代谢物的三个列表上进行，分析根据对每个遗传系的正贡献进行区分。

  注：水平线表示所鉴定的代谢途径的富集倍数。pHu?遗传系的两个最重要的代谢途径是糖酵解和糖异生，pHu +遗传系的两个最重要的代谢途径是蛋白质生物合成和苯丙氨酸 - 酪氨酸代谢途径。

  对血清和胸大肌中的三个单独的OPLS-DA模型鉴定的所有差异代谢物（表2和3）进行代谢物富集分析（MSEA）来鉴定每个肉鸡遗传系中的富集代谢途径。这表明在pHu?遗传系中最具代表性的代谢途径包括碳水化合物途径（糖酵解，糖异生和半乳糖生成等），而pHu+遗传系中为与氨基酸和蛋白质代谢相关的几种代谢途径（图2）。

  图3.通过血清1H NMR，肌肉1 H NMR和31 P NMR的OPLS-DA分析鉴定的光谱拟合多模块OPLS-DA分析

  注：（a）基于拟合模型的多模块OPLS-DA得分图，其中R2Y（cum）= 0.91，Q2（cum）= 0.87。红色三角形和蓝色圆圈分别代表pHu-和pHu +个体。 （b）多模块OPLS-DA和三个单独的OPLS-DA模型的质量判别归纳。 （c）贡献图表明在多模块OPLS-DA中鉴定的代谢物贡献值。1-mehist：1-甲基组氨酸;3-mehist：3-甲基组氨酸; Bet：甜菜碱；DMG，二甲基甘氨酸; Glc，葡萄糖; Glutami ：谷氨酰胺；Hypoxa ：次黄嘌呤；M6-P，甘露糖-6-磷酸; Tau ：牛磺酸；X -….:未知化合物; Xa:黄嘌呤。（d）箱线图表示在内参信号，TSP或NaH 2 PO 4标准化并缩放后在多模块OPLS-DA模型中鉴定的代谢物的NMR标志物。箱线图结构：中值;铰链（第一和第三四分位数），晶须（1.5倍四分位数范围）和异常值。

  在血清和肌肉中由OPLS-DA鉴定的所有光谱特征被包含在一个新的结构为多模块的OPLS-DA模型中，以改进模型并鉴定最相关的代谢物。多模块OPLS-DA包含一个预测和两个正交分量，并具有以下验证标准（R2Y（cum）= 0.91，Q2（cum）= 0.86，P值= 4.42×10-12）。该多模块模型中改进的R2Y（cum）和Q2（cum）标准与其他三个单独模块相比显示出两个遗传系之间更好的分离度（图3a，b）。拟合的模型鉴定了pHu +或pHu-遗传系中对应的16个特定代谢物特征（即肌肉中的葡萄糖，甜菜碱，牛磺酸-甜菜碱，二甲基甘氨酸，精氨酸-赖氨酸和甘露糖6-磷酸，血清中的次黄嘌呤，3-甲基组氨酸，黄嘌呤，1-甲基组氨酸，葡萄糖，精氨酸，谷氨酰胺和麦芽糖）的25个高置信度区间（图3c）。图3d为根据TSP或NaH2PO4内参信号进行归一化后，通过箱线图显示高置信度的差异代谢物水平（2个未知代谢物未显示）。在多模块模型中，肌肉代谢物对模型的贡献比血清代谢物更高。

  图4.与pHu选择相关的代谢调控的概述

  注：1-mehist：1-甲基组氨酸;3-mehist：3-甲基组氨酸;3-HO-butyrate：3-羟基丁酸盐;AA：氨基酸。

  鉴定出的pHu-遗传系中的大多数差异显着代谢物与碳水化合物代谢和能量的产生相关（图4）。这些鸡显示出低AMP / ATP比值（AMP差异倍数= 0.60，ATP差异倍数= 1.08），表明能量丰富。他们没有显示肌肉蛋白质分解或氨基酸分解代谢的任何迹象。相比之下，pHu +遗传系中3-甲基组氨酸（肌肉蛋白分解的标记物）和3-羟基丁酸盐（pHu +中为pHu-中的1.08倍）水平的增加表明生酮氨基酸的降解和脂质β-氧化作为能源生产的替代来源。pHu +遗传系中的能量代谢可能总体上通过进行更多氧化途径，以弥补肌肉中葡萄糖循环和糖原储存的缺乏。

  总的来说，我们观察的结果表明，在pHu +鸡遗传系中糖原以及更普遍的能量储备如碳水化合物的缺乏导致葡萄糖生成途径的激活以及使用脂质和氨基酸作为底物产生氧化能。这种分解代谢将导致尿酸中代谢化合物的释放（例如黄嘌呤和次黄嘌呤）以及通过释放增加的抗氧化剂分子产生ROS（活性氧）从而引起对氧化应激的适应性反应（图4）。

  亮点 

  1. 发现了差异代谢物标记，可用于区分可能产生高或低pHu值肌肉的个体，从而减少家禽肉品缺陷的发生。并且该研究结果也有助于理解肌肉糖原贮积疾病。 

  2. 采用新的多模块OPLS-DA模型，其与三个单独的OPLS-DA模型相比可以去除不相关因素从而鉴定最相关的代谢物。

  参考文献：  

  Serum and Muscle Metabolomics for the Prediction of Ultimate pH, a Key Factor for Chicken-Meat Quality  

  J. Proteome Res. 2016, （IF=4.173）