一种用于大规模检测，鉴定和定量广泛靶标代谢物的新型集成方法：在水稻代谢组学研究中的应用

  摘要  

  通过全扫描的ESI MS/MS数据构建MS2光谱标签（MS2T）文库促进了基于液相质谱（LC-MS）的代谢组学，并利用聚集的标准品MS/MS数据开发了广泛靶向的代谢组学方法。本文中，开发了一种称为逐步多重监测增强子离子扫描（逐步MIM-EPI）的新策略来构建MS2T文库，其中逐步MIM（多重离子监测）作为反馈扫描以触发EPI（增强子离子扫描）的采集。总共获得约698个非冗余代谢物的MS2光谱，其中135个代谢物被识别/注释。整合MS2T文库收集的数据和其他有效的多反应监测（MRM）信息，开发广泛靶向的代谢组学方法定量了277个代谢物，包括一些植物激素。对水稻中这些代谢物的脱水响应和自然变化的评估不仅表明脱水酸（ABA）与干旱胁迫下的代谢物（如5-羟色胺衍生物，多胺混合物）协调调控，而且还显示一些C-糖基化黄酮可以作为区分籼稻和粳稻亚种的潜在标记。新MS2T文库的构建和广泛靶向代谢组学策略可以作为水稻功能基因组学的重要工具。

  材料方法

  植物材料和胁迫处理  

  在华中农业大学实验站自然条件下培育水稻进行检测。所有种子在5月中旬种植在苗床上，并在6月中旬移植到田间。一列植物间的种植密度为16.5cm，行间隔26cm。田间管理包括灌溉，施肥和害虫控制都遵循正常的农业实践。在2011年，采集田间生长的每行三个不同植物标记叶片储存在液氮中用于代谢物提取。  

  2011年夏天，武汉低地水稻品种“珍山97”（籼稻）和高地水稻品种IRAT109（粳稻）种植于精细稻田，用于在具有可移动屋顶的一个避雨所下进行干旱试验。这两个品种在开始阶段通过取消灌溉，排水和下雨时关闭遮盖屋顶进行胁迫实验。相应的对照为正常灌溉条件。干旱胁迫下当植物叶片开始卷曲时，从水田中和干旱田中分别随机选择5个植物的第二叶进行对照和轻微胁迫实验。当叶片完全卷起并且不能再扩展时，在干旱田中随机选择5个植物的第二叶用于严重胁迫实验。水稻核心种质来自中国栽培水稻种质资源。

  化学药品  

  甲醇，乙腈和乙酸购自德国Merck公司。内标lidocaine购自上海新亚药业有限公司。苯丙素类的标准品购自西力生物公司，所有其他标准品购自Sigma-Aldrich。

  样品制备和提取  

  使用具有氧化锆珠的混合研磨仪在30Hz下将冷冻干燥的叶研磨1.5 min，称量100mg粉末，并在4℃下用1.0ml纯甲醇（或70％的甲醇），含有0.1mg L-1 lidocaine内标用于脂溶性代谢物（或水溶性代谢物）。在10000g离心10分钟后，吸取脂溶性提取物并加入0.4ml的提取物混合并过滤后进行LC-MS分析。

  HPLC条件  

  使用LC-ESI-MS / MS系统分析提取的样品。分析条件如下：HPLC C18柱（孔径5.0μm，长度2×150mm）;溶剂系统：水（0.04％乙酸）：乙腈（0.04％乙酸）; 梯度程序：0 min：100:0V / V，20.0 min：5:95 V/V，22.0 min：5:95 V/V，22.1 min：95:5V/V，28.0 min：95.1V/ V;流速：0.25ml min-1;温度：40℃; 进样体积：5μl。流出溶液可连接到ESI-三重四极-线性离子阱（Q TRAP）-MS或ESI-QqTOF-MS。

  ESI–Q–MS/MS  

  在配备有ESI Turbo离子-喷雾界面的三重四极杆线性离子阱质谱仪（Q TRAP）的API 4000 Q TRAP LC-MS/MS系统上获得LIT和三重四极杆（QQQ）扫描图，采用阳离子模式并由Analyst 1.5软件进行分析。

  LIT 实验  

  MIM波长扫描引发EPI扫描模型（MIM-EPI）的信息依赖性采集（IDA），来筛选代谢物。MIM扫描在Q2中使用最小CE（5eV），使得在Q1中分离的代谢物离子以最小的碎片通过Q2。在与Q1相同的代谢离子（而不是碎片离子）处监测Q3。EPI扫描通常采用DP为40.0V，CE为40.0V，质量范围为m/z 50-1000。采用改进的MIM-EPI策略，称为逐步扫描MIM-EPI，其中Q1（Q3）在阳离子扫描模式下设定为50.1-1000.0 Da，质量步长为0.2 Da，例如50.1/50.1,50.3/50.3,50.5/50.5-1000.0/1000.0。每个MIM转换以5-ms停留时间和5-ms暂停时间进行。我们监测每个MIM-EPI实验的60 MIM转换，每个代谢物离子的产物离子在Q3中从50到1,000Da扫描，一次扫描的总周期时间约1.9秒。同时对80个LC/MS进行筛选。

  QQQ 实验  

  作为MRM实验，使用碰撞气体（氮气）设置为5psi获得QQQ扫描。选择Q3质量，DP和CE用于单独的MRM转换作为进一步DP和CE优化的靶向EPI实验的基础。根据在该时间段内洗脱的代谢物，对每个周期监测特定的MRM跃迁。在第一和第三周期分别以阳离子模式监测110和96个MRM跃迁。对于第二阶段，在阳离子模式检测到66个MRM跃迁，阴性模式下检测到11个跃迁（用于检测植物激素）。每个MRM转换以5-ms停留时间和5-ms停顿时间获得，并且扫描模式改变为700ms。第一周期到第三周期的总循环时间分别为1.2,1.6和1.1秒，这确保了每个峰至少获得10个点。使用Analyst1.5软件处理数据;峰面积使用IntelliQuan算法进行积分。

  ESI–QqTOF–MS/MS  

  使用Agilent6520飞行时间（Q-TOF）质谱仪在m/z 50-1000的质量范围内获得HPLC流出物的全飞行时间（TOF）扫描，其配备有双重ESI正离子模式的电喷雾离子源。使用以下设置获得数据：雾化器气体：氮气，40psi; 干燥气体：氮气，10L min-1, 350℃; 毛细管电压：3500V; 碰撞电压：135V;闪光电压，65V; Oct/RFVpp，750V。扫描质量范围：m/z 50-1000，在MS模式中，采集速率为2光谱/s，采集时间为500ms/光谱。对于MS 2，CE设置为10, 20和30V，MS2的隔离宽度为±4m/z。将m/z 121.050873处的嘌呤（C5H4N4）和m/z922.009798处的HP-921（C18H18O6N3P3F24）加入到用于内部质量校准的鞘液中。数据用MassHunter软件处理。

  统计学数据分析  

  将代谢物数据进行log2转换进行统计分析以提高正态性和归一化。为了对38个水稻种质进行分组，将检测到的277个代谢物数据用于R聚类分析（www.r-project.org/）。基于检测到的种质间277种代谢物，使用欧几里得距离“完全连锁”的聚集方法获得分层的聚类体系。色标表示代谢物的强度（经过log2转换）。同时，通过SPSS软件进行无监督的PCA分析。使用Welch's t检验（P<0.01）在ZS97和IRAT10中测定处理和未处理之间的稻叶代谢物的差异。显着变化（P<0.01）的代谢物用于随后的PCA分析。

  结果

  采用称为逐步MIM-EPI的策略，通过MIM-EPI的高灵敏度生成代谢物的MS2T数据而忽略它们的碎片化模式。 主要过程如图1所示，详细见“方法”部分描述。  

  通过应用逐步MIM-EPI策略，从约9500个MIM跃迁获得了超过20000个MS2光谱信号。为了产生包含较少偏差和冗余数据的矩阵，手动检查峰值信号/噪声> 10，并且使用以Perl编写的内部软件来去除冗余信号。冗余移除软件可以通过考虑由不同同位素，源内裂解，K +，Na +和NH4 +加成化合物和二聚化引起的可能冗余来去除大部分冗余。最后获得包含具有产物离子谱（MS2）的698个高质量（s/n> 10），高度可重复和（几乎）非冗余代谢物信号的MS2T文库（补充表1，2和图2）。然后将数据矩阵用于代谢物鉴定/注释和半定量。

  图1. 基于MS2T文库构建和MRM（多反应监测）和基于广泛靶向代谢分析的逐步MIM-EPI（多离子监测-增强产物离子）的主要过程。

  图2.通过MIM-EPI（多离子监测-增强产物离子）检测代谢物。

  （A）具有60个MIM跃迁EPI的TIC（总离子色谱图），m/z范围为446.1至457.9。

  （B）由MIM数据集构建的m/z 449.1的XIC（提取的离子色谱图）。

  （C）在7.18分钟检测到的m / z 449.1的MS/MS质谱图，并且该代谢物已用标准品鉴定为木犀草素-6-C-葡萄糖苷。

  表1 用标准品鉴定的51种代谢物的列表

  a通过阴离子模式检测到十种植物激素，而通过阳离子模式检测其他代谢物。

  基于每种代谢物的碎片化模式，保留时间（RT）和精确的m/z值来注释MS2T文库。然后在此基础上购买市售的标准品，并使用与提取物相同的分析程序进行分析。通过与标准品进行比较m/z值，RT和碎裂模式，鉴定了51种代谢物，包括氨基酸，类黄酮，lysoPC，脂肪酸和一些植物激素 (Table 1)。对于没有标准品的代谢物，MS2T文库中的峰，主要是与鉴定的代谢物碎片化模式相似的峰，通过从文献或搜索数据库（MassBank， KNApSAcK，HMDB，MoTo DB和METLIN）获得MS2光谱数据。然后在DNP和KEGG中搜索最佳匹配到的可能结构。超过80种代谢物被推测鉴定，大多数是（C-或O-）糖基黄酮和黄酮木脂素。

  图3.水稻中一些新注释的代谢物的结构和质谱图。

  （A）（a）C-戊糖基芹菜素O-p-香豆酰己糖苷;（b）C-戊糖基芹菜素O-咖啡酰己糖苷;（c）C-戊糖基芹菜素O-阿魏糖苷;（d）C-戊糖基-黄霉素O-阿魏糖苷。（B）麦黄酮O-鼠李糖-O-丙二酰基己糖苷。（C）（a）麦黄酮4'-O-（丁香醇）醚O-己糖苷;（b）麦黄酮4'-O-（β-二硬脂酰甘油）醚O-己糖苷。（D）阿魏酰腐胺。p-cou：p-对香豆酸; C-pen-ApiDFI：C-戊糖基芹菜素的诊断碎片离子; hex：己糖; caf：咖啡酸; fer：阿魏酸;C-pen-chr DFI：C-戊糖基-金圣草黄素的诊断碎片离子; tri-DFI：麦黄酮的诊断碎片离子; mal：丙二酸；rha：鼠李糖；syr alc：丁香醇; β-glu gly：β-邻甲氧苯基甘油; put：腐胺。

  在水稻中或甚至在单子叶植物中，除了报道的代谢物还有许多新的代谢物被注释。例如，新检测的四种芳族酰化黄酮类化合物被鉴定为C-戊糖基芹菜素Op-香豆酰基己糖苷，C - 戊糖基芹菜素O-咖啡酰基己糖苷（m / z 163是咖啡酸的诊断性片段离子），C-戊基 - 芹菜素O-阿魏糖苷和C-戊糖基 - 黄霉素O-阿魏糖苷（图3A）。一种脂肪族酰化的类黄酮推测为tricin O-鼠李糖基-O-丙二酰基己糖苷（图3B）。将两种黄酮木脂素暂时鉴定为麦黄酮4'-O-（丁香醇）己糖苷和麦黄酮4'-O-（β-甘油基甘油）醚O-己糖苷（图3C）。在水稻叶中也鉴定了阿魏酰腐胺（图3D）。

  图4. ZS97和IRAT10中脱水后变化的代谢物PCA（主成分分析）。

  注：显着性水平设为P<0.01。 PCA显示代谢物组分在不同处理和品种内显着分离。 C145N和C145D1分别代表正常和轻度脱水胁迫条件下的ZS97。 C153N，C153D1和C153D2分别代表在正常，轻度脱水胁迫和严重脱水胁迫条件下的IRAT109。 轻度胁迫：干旱胁迫下植物叶片开始卷曲。 严重胁迫：植物的叶片完全卷曲，无法再吸水膨胀。

  将代谢物数据用于主成分分析（PCA）（图4），反映了这两个品种中代谢物水平之间存在显着差异。第一主成分（PC1）中对照（CK）和干旱处理显着分离，而第二主成分中（PC2）两个品种显着分离。表明干旱处理对代谢水平的影响对于两个品种是可见的，但是在ZS97中的作用比IRAT109更显着。

  初步鉴定的化合物被分配在共同的代谢途径中。比较了两种品种不同处理下的代谢物水平，对显着变化（P<0.01）的代谢物进行标记，同时比较两个品种对干旱胁迫的不同反应（易感性）（图5）。结果表明氨基酸，阿魏酰腐胺和麦黄酮在脱水胁迫下大幅度增加，其中大多数在ZS97中比IRAT109增加更多，除了色胺，甘油-3-磷酸胆碱，5-羟色胺和麦黄酮 O-芥子酰基戊糖苷在IRAT109比ZS97增加更多。相反，LPCs（溶血磷脂酰胆碱），芹菜素-C-己糖基-C-己糖苷和木犀草素-O-己糖基-C-己糖苷在脱水胁迫下显着降低。尽管在两个品种中观察到对干旱代谢响应的类似趋势，我们确实发现巴碱在两个品种间显示相反的响应。巴碱（烟酸甜菜碱）是烟酸的N-甲基缀合物，并且已被推测在响应盐和干旱胁迫时作为相容性溶质起作用。在ZS97中在轻度干旱胁迫下观察到巴碱的水平增加超过10倍，而在IRAT109中巴碱的水平降低两倍。

  在脱水胁迫（图5）下ABA和Trp途径的产物（Trp，5-羟色胺等）的协调累积表明干旱诱导的血清素累积也是具有部分ABA依赖性的。 尽管对拟南芥中黄酮类化合物以及其他酚类衍生物如多胺缀合物以及它们对不同环境刺激（包括干旱胁迫）的反应已经有广泛研究，但干旱胁迫对水稻的影响仍然是未知的。

  图5. ZS97和IRAT10中脱水后变化的代谢物水平的比较

  图6.根据检测到的277种代谢物获得38个已鉴定水稻种质的PCA（主成分分析）得分图。

  注：淡蓝色，蓝色，红色和粉红色点分别代表粳稻，香型水稻，早中期水稻和籼稻品种。

  第一组中的所有20个品种是籼稻亚种。第二组包含18个属于粳稻亚属的品种，除了Dom Sufid（芳香品种）和N22（澳大利亚品种）。这个结果表明籼稻和粳稻品种之间的不同类型差异。同时进行了PCA分析，结果显示PC1可以清楚地分离籼稻和粳稻亚种（图6）。

  表2：籼稻和粳稻间区别最显着的差异化合物累积的列表

  注：a Log2平均值（籼稻），检测的所有籼稻品种的代谢物平均水平的log2转换值;

  b log2平均值（粳稻），检测的所有粳稻品种的代谢物平均水平的log2转换值;

  c比率（i / j）：平均值（籼稻）/平均值（粳稻）。

  列出了PC1的最大正荷值或负荷值的前10个代谢物，计算了其在籼稻和粳稻之间的平均含量（表2）。四种最重要的代谢产物（黄芪六醇-6-C-己糖苷，C-戊糖基-芹菜素O-阿魏糖苷，C-己糖基-胆固醇O-己糖苷和O-甲基芹菜素6-C-己糖甙）在籼稻中的平均含量约为粳稻中的120，87,140和670倍，而粳稻品种中麦黄酮-O-糖苷（麦黄酮-O-己糖基-O-己糖苷）水平显着高于籼稻（表2）。通过比较来自籼稻和粳稻的DNA序列来充分表征籼稻和粳稻亚种的分化。

  亮点  

  1. MS2T文库的构建以及广泛靶向的分析方法使得我们能够筛选大量样品用于定量水稻中广泛的代谢物。  

  2.基于序列的全基因组关联（GWA）研究和代谢组学分析的综合方法不仅揭示了代谢轮廓的遗传基础，并且有助于了解不同性状/不同胁迫条件下植物的表型多样性的代谢组学基础。

  参考文献  

  A Novel Integrated Method for Large-Scale Detection, Identification, and Quantification of Widely Targeted Metabolites: Application in the Study of Rice Metabolomics  

  Molecular plant IF=7.142