全长转录组在非模式生物中的研究思路

牙鲆多种免疫相关组织的全长转录组测序

期刊：Fish and Shellfish Immunology   IF：3.298

材料方法

材料：  将20只健康的牙鲆鱼集中驯养。随机选取三条鱼，取其鳃、肠、肝和肾组织冷冻保存，提取RNA.

测序平台：PacBio

数据量：  25.45G

实验流程

结果分析

1 .测序质量控制

       将测序所得raw data质量控制后，得到clean data 25.45G，平均读长为1538bp（图2a）。subreads自校正后获得446935个CCSs（循环一致性序列），用于flnc（全长非嵌合序列）的鉴定。共鉴定到平均长度为2482bp的379,671个flnc（表1）。然后将205,747个精确的共有读数与参考基因组进行比对，其中87.69%被定位到牙鲆P. olivaceus的基因组中(表2)。如图2b所示，对每个转录本的基因组序列的覆盖范围和同一性进行了分析，发现大多数转录本(> 70%)显示出非常高的相似性(> 98%)。

2.转录本数据分析

       通过对全长转录本的分类（图3）、可变剪切事件的统计（图4）、聚腺苷酸化位点与基因数量的统计（图5）、转录因子（图6）及lncRNA（图7）的分析，在牙鲆的免疫相关组织中总共发现了60,448个CDS，12,540个AS事件，9296个APAs，7720个新基因，10,270个lncRNAs，5400个融合转录本和2298个转录因子。利用AS与APA分析基因结构，获得了更多样的基因亚型。通过融合转录本和转录因子预测转录后调控网络，发现了更多的抗病原体感染的免疫相关基因。并通过分析lncRNAs获得蛋白质组多样性。这些结果均表明，全长转录组测序不仅提供了全长基因，而且获得了更精确的数据，说明它们可能在不同的免疫反应中起重要作用。

3.功能分析

       对所有全长转录本进行GO分析（图8a），KEGG分析（图8b）与KOG分析（图8c），发现从混合免疫相关组织中鉴定的大部分全长转录本富含免疫相关信号通路。如图，GO注释中富集最丰富的途径包括细胞过程、代谢过程、膜及催化活性等途径。KEGG注释的进一步分析显示大部分转录本的免疫系统、信号转导途径、传染病-病毒等富集途径较为丰富；且通过KEGG途径富集分析注释了2600个新转录本，其中151个新转录本在免疫系统中富集。KOG分析中富集程度最高的途径为信号转导机制（T），其次为仅一般功能预测（R）、翻译后修饰、蛋白质翻转、伴侣（O）等。

4.mRNA-miRNA相互作用调控网络的构建

       研究中共发现了28,715个mRNA-miRNA，包括20,813个mRNA和291个miRNA。经鉴定，28.5%的mRNA被至少一个miRNA调控。miRNA作为转录后调节因子，可以诱导免疫反应中目标mRNA的降解或翻译抑制。这些结果为miRNA相关的转录后调控的潜在机制提供了重要的基础，对mRNA-miRNA相互作用网络的预测有助于阐明mRNA和miRNA之间的调控关系。

结论

       本研究通过第三代测序获得更完整、更准确的转录组数据集，进而探索牙鲆潜在的免疫相关调控机制。转录组分析揭示了关于转录本多样性的更多信息，包括全长转录本、转录本的同种型、腺苷酸化、新基因、转录因子、lncRNA、融合转录本和潜在的mRNA-miRNA相互作用网络。通过功能注释和结构分析鉴定出大量免疫相关信号通路。本研究不仅改进了牙鲆现有的全长转录本，而且增强了对牙鲆基因结构、转录后调控网络以及随后的蛋白质组多样性的理解。

亮点

       尽管RNA-seq已经为宿主-病原体相互作用提供了有价值的视角，但仍然存在一些缺点，如测序长度短，剪接不完整或不准确。本研究首次提出了从免疫相关组织(鳃、肠、肝和肾)的混合RNA样品中利用PacBio SMRT技术获得的牙鲆全长转录组。在这项研究中，产生了379,671个全长非嵌合(flnc)序列，平均长度为2482 bp，比以前在牙鲆中报道的任何读数都长。且全长转录本信息读取更加完整、准确，数据分析更加全面可靠。因此三代全长转录组测序在如今的科研中应用更加广泛，特别是针对非模式生物转录组研究，俨然已经成为主流的研究方法。

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