久违的干货分享来了！——扩增子、宏基因组超全送样指南系列（人体篇）
发布日期：2021-08-20 浏览次数：2542
您是否有这种困扰？好不容易确定好研究方向、研究手段后，随之而来又一个新的问题——取样。然后就会出现一系列问题，比如：取哪里比较好？怎么取？取多少？什么条件保存？想自己提取怎么办？今天，小编带着微生物样品超全送样指南来了，有需要的小伙伴可以收藏呦~
Ps:1.本取样方法及送样要求适用于大部分扩增子测序及宏基因组测序样本，以下样品量以扩增子测序为例，宏基因组样品量请在下文基础上增加2-3倍。2.采样过程应保证无菌条件，尽量避免对样本的干扰，样本采集后，请尽快将样本置于-80℃保存或液氮速冻保存，且尽快干冰寄送。使样本尽可能代表自然状态下的微生物原貌，避免样本储存不当影响实验结果。
人体微生物样本
01 粪便样本
立即提取或立即将样本冷冻在干冰或液氮中，然后在-80℃保存，直到核酸提取。在条件不允许的情况下可直接使用添加保护液的保存管常温短期保存，也可以不用保护液低温冻存。考虑实验重复及后续样本重复使用，建议一次采集2-3g样本，并根据实验需要检测的次数对样本进行均质后分装保存，每份重量不低于250mg。保存样本时，尽量保证收集容器无菌，避免交叉污染。因样品外部易污染环境微生物，且受环境影响易导致核酸降解，采样时尽量选择样品中段、里部，有条件的可以使用专用无菌采样纸、便盆或采样袋。
02 皮肤样本
皮肤表面所得的微生物丰度较低，使用无菌植绒拭子（棉拭子）更利于采集样本。每次实验需要一个无菌独立拭子，可以使用SCF-1（50mmol/L Tris pH 7.6、1mmol/L EDTA pH 8.0、0.5% Tween-20）湿润的拭子，施加稳固的压力，在30s内在采样部位来回摩擦50次，折断无菌拭子头于收集管中保存，建议提供采集拭子5-6根。
03 鼻腔样本
用无菌植绒拭子围绕鼻孔粘膜表面区域旋转2 次，直接冷冻，或将拭子在收集管缓冲液中旋转，并将拭子在管壁上多次按压20 s，确保微生物转移到缓冲液中。每个鼻孔单独使用一个拭子，最后可以将左右鼻孔采集到含微生物的收集缓冲液合并至一管保存。
04 口腔样本
24h内不刷牙，取样前1h，不要进食、吸烟、饮水、饮酒或嚼口香糖等，建议晨起取样。
(1) 唾液：舌头抵住上颚至少1min，将收集的唾液吐至无菌收集管中。重复上述步骤直至收集到足够的量(2-5 mL)。
(2) 软组织：各部位用一个无菌拭子采集。①舌背：在舌背中间1平方厘米处擦拭5s。②上颚：整个上颚擦拭10s。③粘膜：左右两边各擦拭10s，尽量不要碰到牙齿。④角质化牙龈：上颚前牙龈擦拭10s。⑤扁桃体颚：左右两边各擦拭5s。然后，将拭子在收集管缓冲液中旋转，并将拭子在管壁上多次按压20s，确保微生物转移到缓冲液中。
(3) 硬组织：用刮匙刮取相应部位获得菌斑。①龈上菌斑：刮取2颗臼齿(#3，#19)，2颗前磨牙(#12，#28)，2颗门牙(#9，#25)菌斑后，将刮匙尖端浸入收集管缓冲液中4-5s，将刮匙表面在收集管内边缘擦拭，可重复上述收集操作。②龈下菌斑：用棉球擦干采样区域，并擦去残留龈上的菌斑，用刮匙刮取目标牙齿菌斑后，将刮匙尖端浸入收集管缓冲液中4-5s，将刮匙表面在收集管内边缘擦拭。
05 生殖道样本
48h内无性行为，不得进行私处清洗、上药等改变菌群结构的行为，30d内不能用抗生素和抗真菌类药物。取一个无菌植绒拭子轻柔旋转擦拭5次，拭子在收集管缓冲液中旋转，并将拭子在管壁上多次按压20s，确保细菌转移。
06 脑脊液样本
取脑脊液样品5mL，依次放入5个无菌管内(每管1 mL)，尽量减少血液混入。一般采用第2或第3管提取核酸。为避免脊柱索损伤，选择第3、第4或更低腰椎进行穿刺；儿童脊髓圆锥比成人低，因此，抽取儿童脑脊液时应该选择第4、5腰椎。
07 肺泡盥洗液样本
用1%的利多卡因对患者进行口咽部局部麻醉，静脉推注咪达唑仑 5 mg。患者取仰卧位，予吸氧、心电血压监测。用支气管镜行支气管肺泡灌洗术，对拟要灌洗肺段经气管镜活检孔注入1%利多卡因局部麻醉，将气管镜嵌入右肺中叶或左肺上叶舌段的一个亚段，共注入120 mL 加热至37℃的生理盐水，用50mL注射器回收后，4℃存放并尽快送到实验室。分装后高速离心，15600×g 4℃离心30min，弃上清，细胞沉淀－80℃冻存备用。
08 血液样本
如检测血浆，可采用塑料材质采血管抽取3-5mL全血，颠倒混匀抗凝剂与全血，保证抗凝效果。避免反复冻融保存。
09 尿液样本
清洁双手，采集尿液之前用中性肥皂水或者清水对尿道口周围进行清洁，用无菌尿液收集器收集至少5mL中段尿尿液，将尿液样本立即置于-80℃保存。
