新鲜的干货分享第二弹！——扩增子、宏基因组超全送样指南系列（动物篇）

取样干货分享第二弹来啦！

这次是动物篇

还是老规矩，有需要的小伙伴可以收藏呦~

Ps:

1.本取样方法及送样要求适用于大部分扩增子测序及宏基因组测序样本，以下样品量以扩增子测序为例，宏基因组样品量请在下文基础上增加2-3倍。

2.采样过程应保证无菌条件，尽量避免对样本的干扰，样本采集后，请尽快将样本置于-80 ℃保存或液氮速冻保存，且尽快干冰寄送。使样本尽可能代表自然状态下的微生物原貌，避免样本储存不当影响实验结果。

动物微生物样本

01 大中型动物粪便样本的采集

        在清晨集中采食时或采食后不久的一段时间后，收集新鲜的粪便样本。用无菌的粪便取样器（如无菌棉签）进行粪便样本的取样。因粪便表层含有肠粘膜脱落细胞，而外部容易污染，且接触空气后，部分细菌 DNA 开始降解，所以取样时要截取中段内部的粪便样本（200~500 mg），并立即置于无菌的2 mL冻存管中，用封口膜封口，每个样本取 3-5 管备份。注意事项：尽量避免粘连沙土和碎石，同时尽可能不要取较稀或尿液过多的部分。样本采集分装好后，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行DNA抽提或-80℃保存。注意在样本冻存期间，请勿反复冻融，以免影响后续实验结果。

02 小型动物颗粒粪便样本采集

方法一：将待取样的小鼠放进干净的铺有无菌滤纸的笼子中，小鼠排便后立即收集粪便样本；对不同的小鼠取样时需更换新的滤纸；单个小鼠收集3~5粒粪便至EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存。

方法二：用手指捏着小鼠颈后提起小鼠；同时固定住小鼠的尾巴（灌胃和腹腔注射的姿势，可轻轻挤压小鼠尾巴根部直肠末端），待小鼠排便后，收集粪便至无菌冻存管中，液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存。

03 肠道内容物

        待实验对象死亡后，在无菌操作台或灭菌环境下用无菌解剖刀取出整个肠道，切取所需肠段。用无菌手术刀挖取内容物，装入无菌2 mL冻存管中（100-200 mg/管），每个样本取3-5管备份；收集样本时，若肠道粘膜或者粘液含量较多会影响提取和扩增，所以样本收集时一定要将内容物刮出置于收集管中。若只剪开肠道，久置肠道粘膜或粘液会与肠道内容物浸泡在一块，后期取样不好分离，影响实验结果。样本采集分装好后，立即置入-80 ℃冰箱保存。注意在样本冻存期间，请勿反复冻融，以免影响后续实验结果。注：对于肠道极小的动物，如无法用解剖刀剪等工具挖取内容物，可采用无菌注射器或移液器吸取少量无菌生理盐水，将注射器针头或移液器吸头插入肠道中，将内容物冲出的方式收集样本。若冲洗后的液体较多可通过离心富集沉淀。

04 肠道组织

方法一：肠道样本用无菌PBS缓冲液轻轻清洗，直到没有内容物流出；用无菌的显微镜玻片刮取附着在表面的组织细菌进行DNA的提取。

方法二：取相应肠段样本，在无菌操作台上用灭菌解剖刀或剪刀切取指甲大小（1cm2左右）的组织块，放入离心管中。上述操作完成后，迅速放入液氮中1h以上，然后置入-80°C保存。

05 瘤胃样本

        ①采集前，试验动物须进行 15 天以上的预饲，采集时间根据具体研究内容而定，避免在刚采食饮水后进行。②通过瘤胃瘘管法、口或鼻插入胃管法、穿刺法，收取瘤胃液内容物（10-15mL），通过四层无菌纱布过滤，滤液采用 12000 × g 离心10 min，收集沉淀。由于该类样本很容易降解，因此需立刻置于-80℃或者液氮保存便于后续 DNA 的提取。