Genome Biology | WGCNA和eQTL分析揭示了梨果实石细胞性状的调控网络

      2021年11月14日，基因组学顶级期刊 Genome Biology（中科院一区，IF=13.583）在线发表了题为“A systems genetics approach reveals PbrNSC as a regulator of lignin and cellulose biosynthesis in stone cells of pear fruit”的研究论文，该研究通过对206份栽培梨进行转录组测序，同时结合WGCNA和eQTL分析构建调控网络，并通过瞬时转化和稳定转化体系分别对PbrNSCs基因进行功能验证，揭示了PbrNSC是梨核细胞木质素和纤维素生物合成的调节者，从而为梨果实石细胞性状的调控研究提供了新见解。

研究背景

      梨属于蔷薇科，是最重要的温带果树作物之一，全球年产量约2400万吨。与其他蔷薇科植物不同，梨在果肉中积累了大量的石细胞。这些细胞团带有加厚的细胞壁材料，导致质地粗糙，水果口感差。石细胞是厚壁组织细胞的一种，其次生细胞壁在细胞停止扩张后沉积在初生壁上。木质素和纤维素是地球上含量最丰富的两种生物聚合物，是石细胞次生细胞壁的主要成分。已知核细胞的形成与梨果肉中木质素和纤维素的生物合成、转移和沉积密切相关。了解木质素和纤维素在果实中的合成和积累的遗传调控对提高果实品质具有重要价值。然而，我们对果实组织中木质素和纤维素积累的基因调控网络的理解仍然有限。

技术路线

材料：206份梨果实

测序策略：转录组测序，Illumina平台（6G数据量）

研究技术路线

研究结果

01 梨果实表型测定及整体基因表达分析

      对206份具有广泛的遗传多样性和较大的表型变异的沙梨进行研究，通过测定了石细胞中木质素和纤维素的含量，发现砂梨品种的木质素和纤维素含量与石细胞含量呈正相关。结合RNA-seq技术总共检测到35,897个基因的表达，占梨注释基因的84.9%。平均每个梨中表达基因数目是25636个。

图1  梨的性状概览

02  基因共表达模块和eQTL定位

      采用WGCNA分析来确定候选的性状连锁模块，总共鉴定了33个模块。其中7个模块(M10-M14和M25-M26)，包括4383个基因，它们与石细胞含量显著相关。对这些模块进行GO分析，发现许多富集过程可能与次生细胞壁代谢有关。同时，从RNA-seq数据中获得了高质量的974,404个SNP。在SNP集合中，97.1%的SNP位于28,238个基因内。利用4重简并位点的SNPs构建的系统发育树显示出两个不同的具有地理分离特征的分支，其中分支I包含来自中国的种质，分支II包含来自日本和韩国的种质。为了确定潜在参与表达调节的遗传变异的影响，总共使用了25，828个基因，其表达中位值大于零的品种用于eQTL作图。最终获得了833，872个可能调节18，435个基因表达的eQTLs。

图2  WGCNA和eQTL分析

03 梨木质素和纤维素结构基因的共表达网络及候选eQTL

      进一步利用WGCNA进行基因-性状关联研究，共鉴定出45个与梨果实中石细胞含量显著相关的结构基因，其中36个与木质素相关，9个与纤维素相关。在石细胞模块中，M13模块包含的木质素和纤维素相关结构基因数量最多。此外，基于206个梨品种和3个品种中7个不同发育阶段的基因表达谱，研究者构建了一个包含转录因子(TFs)和39个木质素和纤维素结构基因共表达网络。在木质纤维素共表达网络中发现了两个NAC TFs，8个hub MYB TFs分别于调节纤维SCW增厚和激活木质素生物合成有关。

研究者进一步整合了木质纤维素共表达网络和石细胞eQTL图谱，确定了PbrNSC对梨石细胞形成过程中木质素和纤维素的生物合成有调节作用。

图3 与梨木质素和纤维素结构基因相关的共表达网络和候选QTL

04  PbrNSC参与了石细胞的形成

      为了进一步阐明PbrNSCs在石细胞发育中的功能作用，通过梨果实的瞬时转化体系表明PbrNSC的过度表达与木质素和纤维素含量的增加以及PbrNSC的沉默与木质素和纤维素含量的降低之间存在明显的相关性；再结合拟南芥的稳定转化体系，结果表明PbrNSCs在SCW增厚中起作用。

图4 多组学证实PbrNSC参与了石细胞的形成

05  Lp-和Wq-box是PbrNSC的转录激活结构域

      研究准备利用梨和拟南芥NAC转录因子(TF)的氨基酸序列构建了系统发育树。PbrNSC位于被认为是SCW合成的调节因子AtNST1、AtNST2和AtNST3附近。在SCW分支中，PbrNSC是唯一在果实发育早期大量表达的基因。另外发现PbrNSC蛋白C端区域发现了两个高度保守的基序(LP-box和WQ-box)。

研究者使用双荧光素酶分析来检测PbrNSC与eQTL定位中确定的与PbrNSC相关的多个基因的启动子之间的潜在相互作用，发现PbrNSC与启动子相互作用，激活了PbrMYB169，Pbr4CL4，和PbrLAC4三个基因的转录。NAC TF的转录激活区通常在C-末端，PbrNSC的LP-box和WQ-box基序在C-末端。因此，推测这两个结构域可能在转录激活中发挥作用。

图5  PbrNSC激活梨SCW基因的转录

06 PbrNSC的Lp-和Wq-box负责激活下游基因并影响次生细胞壁的形成      

      为了研究Lp-box和Wq-box在SCW合成中的作用,进一步使用拟南芥中含有pbrNSC、PbrNSC 缺失LP及PbrNSC缺失 WQ转基因的nst1/nst3突变体进行实验，发现两个结构域任何一个结构域缺失都会使得植株中SCW不能正常发育。此外，在WT和PbrNSC株系中检测到束间纤维细胞中的纤维素沉积，但在含有PbrNSC突变体的nst1/nst3或其转基因株系中，纤维素沉积较弱。这些结果进一步支持PbrNSC的LP-和WQ-box负责激活次级细胞壁相关基因，促进木质纤维素的排布。

图6  PbrNSC激活次级细胞壁形成基因的表达

总结

      研究者用系统遗传学的方法阐明了梨果实石细胞形成的分子调控机制。发现PbrNSC是石细胞形成的调节因子，从而加深了我们对果树次生细胞壁调控的理解。本研究证明了系统遗传学方法在检测果树作物复杂品质性状调控因子方面的有效性。

小编点评

      石细胞主要由木质素和纤维素构成，其涉及次生代谢的复杂调控，因此解析该性状形成的调控网络存在诸多困难。在这项研究中，研究者通过整合木质纤维素共表达网络和石细胞 eQTL 图的系统遗传学方法成功鉴定了梨果实中石细胞形成的调节剂PbrNSC，并通过瞬时转化和稳定转化体系证实了PbrNSC的功能，这种研究方法不仅有助于我们了解梨果实石细胞中木质素和纤维素形成的基因调控网络，同时能为其他果树特定性状的综合调控研究提供参考意义。

原文链接：

https://link.springer.com/article/10.1186/s13059-021-02531-8