Plant Biotechnology Journal |336份海岛棉重测序和GWAS分析揭示其谱系演化关系和重要品质相关基因
发布日期：2021-11-26 浏览次数：2229
期刊：Plant Biotechnology Journal
IF:8.154
关键词:海岛棉，GWAS，纤维品质，产量，枯萎病抗性
摘要
海岛棉(Gossypium barbadense)是世界上纤维品质最好的棉花，但对不同种质间的遗传变异、重要性状的基因和系谱选择的影响却知之甚少。本研究利用广泛的海岛棉种质资源（包括中国海岛棉种质资源），对336份海岛棉重测序分析，鉴定了1600万个SNPs。系统发育分析和群体结构分析揭示了两个主要的基因库和第三个由地理传播和杂交育种衍生的混合亚群。对纤维品质、产量、抗病性、成熟度、株型等15个性状进行了全基因组关联研究( GWAS )。关联位点数量最多的是纤维品质，其次是抗病和产量。通过转录组和VIGS转基因技术确定了5个候选基因对抗病、纤维长度、纤维强度和衣分4个关键性状的调控作用。从地理和时间两个方面考虑，在我国改良海岛棉的过程中，选择了纤维质量优良(纤维长度和强度)和高绒率。系谱选育提高了对枯萎病的抗性，并分别提高了纤维品质和产量。本研究结果为了解海岛棉的基因组变异和选择育种奠定了基础。
材料与方法
重测序材料：
从中国农业大学的种子储备中收集了336份来自全球主要棉花生产国的海岛棉品种。分别来自亚洲(274份)、非洲(32份)、美洲(28份)和欧洲(2份)
Illumina HiSeq PE150（数据量：共9.4 T ）
336份海岛棉花品种的地理分布情况
参考基因组：http://cotton.hzau.edu.cn/EN/download.php
转录组测序：五个海岛棉花极端品种(XH37/XH58/XH33/LuoSaiNa/AShi)。在0 DPA、5、10、15 、20、25 DPA收集样品，三组生物学重复。Illumina HiSeq PE150。
VIGS转基因实验
系统进化和群体结构：NJ进化树（TreeBestv1.9.2软件），PCA分析：GCTA 1.24.2，群体结构：Admixture (1.23)。
θπ，FST：VCFtools (v0.1.15)，LD衰减：Plink v1.07（1000k）。
全基因组关联分析：GEMMA 0.94.1
研究结果
海岛棉全基因组变异与群体结构
对336份海岛棉样品进行重测序，平均测序深度为11.2×，约98.77%的reads覆盖了97.09%的参考基因组，共鉴定出1600万（M）个SNPs和2.3M InDels。对于结构分析，LnP(D)值从K=1持续增加到7，没有明显的拐点(图S2b)；然而，△K值在K=2处出现峰值。这表明有两个主要的基因池，与系统发育树、群体结构分析和主成分分析PCA结果一致。由于地理分布和育种实践的种内渐渗，部分地方品种和过渡品种在K = 2时增加了一个新的中间水平的祖先比例，整合为第三个混合亚群。
Pop1亚群（76份）：主要包括我国西北内陆棉区近年选育的纤维较长、较强的海岛棉品种(纤维长度，FL平均=42.47mm；纤维强度，FS平均=43.63cN/tex)。
“混合”亚群（91份）：主要包括中国主要棉花种植区的地方品种和全球其他棉花生产国的过渡品种，纤维质量中等(FL平均=37.12mm；FS平均=37.97 cN/tex)。
Pop2亚群（169份）：包含全球棉花生产国的大部分早期品种，纤维较短，强度较低(FL平均=36.29mm；FS平均=36.54cN/tex)。
336份海岛棉种质的系统发育、结构分析、主成分分析、遗传多样性和LD衰减。
全基因组关联分析
6年的时间里，在海南、新疆库尔勒等四地种植336种海岛棉，测量了15个性状（表2），包括纤维质量（5）、产量成分（5）、抗病性（1）、 成熟度（2）、植物结构（2）。所有性状的表型变异均存在差异。
基于对该海岛棉群体15个性状进行了全基因组关联研究，获得关联位点；基于388kb LD衰减距离和候选基因分析，确定了一个显著SNP峰值(即共1Mb区间的上下游500kb(略大于388kb)为候选区域大小，发现18696个独特基因，涉及6183个与至少两个性状相关的共同基因。筛选其邻近影响性状表型变异的关键基因，通过转录组分析和VIGS实验进行初步验证。
纤维长度
在A05染色体上发现了GbFL2（Gbar _ A05G017500）基因（编码含U - box结构域的E3泛素连接酶( PUB4 )），相关SNP ( 16286973 )导致T / G颠换，导致亮氨酸( L )变为缬氨酸( V ) ，分别与长( T )或短( G )纤维表型相关。
大多数早期引进品种（Pop2）具有长纤维单倍型，在育种过程中（"混合"群体）长/短纤维单倍型比例接近相等，长纤维( T )单倍型在Pop1亚群中突显，占该位点单倍型的83.33 % 。GbFL2在纤维转录组数据中表达量逐渐降低( 从 0DPA到 20DPA )，在长纤维品种中表达量较低(图2f )。利用qRT-PCR验证了GbFL2在FL极端种质中的负调控模式。GbFL2在高、低FL株系中的VIGS转化表现出相对于野生型的纤维长度增加(图2h-i )，验证了GbFL2在纤维伸长中的作用。GbFL2来源于AD2的At染色体(即A05)(图2j)，育种过程中单倍型频率的变化提示了驯化过程中的定向选择。
At05染色体上FL相关基因GbFL2的鉴定
纤维强度
对于纤维强度，我们鉴定了候选基因GbFS1（Gbar _ D11G032670）(编码酪蛋白激酶I)。通过赤霉素信号通路调控海岛棉花的纤维强度，且起负调控作用。
衣分
在A05染色体上还鉴定到一个编码ATP依赖的RNA解旋酶 (DEAH12)基因GbLP1（Gbar _ A05G014160），SNP ( A05：13046765 )使C / G颠换，导致氨基酸差异（丙氨酸( A )变成甘氨酸( G )），后者与衣分显著提高有关(图3b-d )。与GbFL2和GbFS1不同的是，自海岛棉引入我国以来，具有高衣分单倍型( G )的种质数量总体上呈逐渐减少的趋势；高/低衣分单倍型比例出现先增加后降低的波动。GbLP1在高衣分材料纤维发育早期高表达，与qRT-PCR验证一致。
进化分析显示GbLP1经历了正向选择，而它在Dt基因组中的同源基因则经历了纯化选择。值得注意的是，大多数现代海岛棉品种都是长纤维、低强度、低衣分，其次是高衣分但纤维短而强度低的品种，说明了中国海岛棉最优先的定向选择是针对长纤维的，其次是高衣分。
At05染色体上LP相关基因GbLP1的鉴定
枯萎病抗性
作者还在D03染色体上筛选到与抗枯萎病紧密相关的两个基因：GbDP1（编码锌指同源结构域蛋白6（ZHD6））和GbDP2（编码细胞壁相关受体激酶样14(WAKL14)）。通过对海岛棉花的VIGS转基因实验证实了它们对各自表型的影响：GbDP1和GbDP2在易感(S)株系中均表现出高表达，呈负调控模式。
尽管这两个基因在AD1-AD2之间具有高度的保守性，但海岛棉和陆地棉D-同源体的进化选择分析表明，它们的选择历史不同。
Dt03染色体上DP相关基因GbDP2的鉴定
系谱分析
从GWAS群体中选择了一个完整的家系，考察两个来自同一初始育种池( 11个共同亲本)的优良品种XH39和XH60，分别具有长纤维( XH39 )和高衣分( XH60 ）。通过与亲本基因组序列比对，分别追踪到4.57%和3.78%的遗传片段，大部分位于At基因组。对于XH39，研究发现在这些重叠区域中有32个和178个控制着纤维长度和强度的基因。有4个基因同时影响了FL和FS，其中Gbar_A04G013270和Gbar_A04G013290在转录组5-25 DPA纤维上高表达，呈正调控模式（特别是在10和15DPA上），遗传于亲本86430，值得注意的是，在13个亲本系中86430纤维最长。Gbar_A04G013270编码了糖酵解途径产生能量的关键酶：三磷酸异构酶，而Gbar_A04G013290是一个新注释的基因，功能未知。对于XH60，发现了70个与衣分相关的基因。其中Gbar_D04G017350（编码微管蛋白α-2链）在纤维发育早期(0、5、10、15DPA)高表达并且呈负调控(图6h)。该基因亲本来源于JH1（在13个亲本中衣分最低）。
海岛棉品种XH39的系谱分析
海岛棉品种XH60的系谱分析
本研究利用广泛的海岛棉种质资源，通过重测序和GWAS分析对海岛棉基因型到表型的关联进行了研究。揭示了与海岛棉关键纤维和抗病性状相关的基因，包括驯化相关的潜在等位基因和表达变异。XH39和XH60的谱系分析为提高纤维质量和产量以及提高对枯萎病的抗性提供了依据。本研究为了解中国海岛棉花的多态性、其他来源的渐渗和人工选择奠定了基础。此外，这里确定的纤维质量、产量和抗病性的关键基因可以进一步探索，例如，解读它们参与调控网络以及基因型与表型连接的关系。具有优良单倍型组合的优良海岛棉品种对棉花改良具有巨大的农艺潜力。本研究为探索、理解和利用这个广泛的基因库提出了重要的一步。
