Plant Journal | mGWAS分析揭示了枣驯化过程中代谢物变化的遗传机制

      枣是我国重要的水果之一，具有较高的营养和药用价值，充分研究枣的代谢物对其遗传育种具有重要意义。2021年12月4日，国际知名植物学杂志 The Plant Journal（中科院1区，IF=6.417）在线发表了题为“Jujube  metabolome  selection  determined  the  edible  properties  acquired  during domestication”的研究论文，该研究通过对207份不同品种的枣进行重测序、代谢组和转录组测序，同时结合GWAS、mGWAS分析，深入探讨了枣驯化过程中代谢物变化的遗传机制，并揭示了次生代谢物对果实风味形成的重要性，从而为果树驯化研究提供了新见解与新思路。

研究背景

      植物同时具有食用和药用功能，主要是因为植物中具有丰富的初级和次级代谢产物。枣兼具食用和药用功能，最早报道的人工栽培枣树出现在7000年前的黄河流域，但野生枣的驯化起源于270万年前，表明长期的自然和人工选择驯化了枣树的特性。已有研究表明，枣树果实酸/甜的驯化是基于对决定酸和糖含量的基因选择，但是枣驯化过程中代谢组的变化以及随后分化过程及遗传调控机制尚不清楚。

研究思路

材料：207份不同品种的枣（25份野生枣、182份栽培枣）

组学策略：代谢组+重测序+转录组

研究技术路线

研究结果

01 野生枣栽培驯化的基因组学研究

      利用Illumina平台对207份不同品种的枣进行了基因组重测序，平均深度13.27×，平均覆盖度95.63%，通过比对与过滤，共获得了6,604,346个高质量的SNP位点，这些变异位点为枣树育种和生物学研究提供了新的资源。

      通过主成分分析，发现了两组截然不同的野生和栽培枣。这一发现与系统发育关系假设的“枣起源于单一野生枣驯化事件”的结果一致。野生酸枣到栽培酸枣，核苷酸多样性也出现下降，这表明枣的驯化过程中存在一个微弱的瓶颈事件，这与苹果类似同时也和Fst结果一致。连锁不平衡分析（LD）结果表明，栽培枣树的LD衰减速度比野生枣树要慢，即具有更大LD值。这些结果表明，通过长期的自然或人工选择，野生枣被驯化为具有中度遗传差异的栽培枣。

图1 野生型栽培驯化基因组研究

（A.PCA图、B.Fst分析、C.LD分析）

02 枣树驯化过程中的全基因组选择特征

      为了识别与红枣驯化相关的位点，将野生红枣与栽培红枣的Fst和跨种群综合相似度（XP-CLR）值最高的前5%的区域认定为驯化消除。识别出了109个区域，覆盖了25.92Mbp的长度，包含1559个基因，主要分布在1、4和10号染色体上。通过KEGG富集分析，主要富集在氨基糖和核苷酸糖代谢、类胡萝卜素生物合成、甘油脂代谢等。此外，还发现有大量驯化基因参与次生代谢物合成、糖类代谢等生物途径。

      水果口味包含甜度/酸度，这也是水果驯化过程中主要的选择。与此前报道一致，与糖和酸以及运输相关的基因都被鉴定出来，主要参与调控蔗糖合成酶、丙酮酸激酶等。同时还确定了两个可能参与枣树驯化的新家族和鉴定出了控制枣树开花时间的基因。次生代谢的生物合成也在枣树驯化过程中具有很高的选择性。这些结果表明，这些候选基因的选择可能导致野生红枣和栽培红枣的代谢差异，从而达到改善风味与适应环境的目的。

图2 基因选择特征

（AB.基因覆盖情况、C.Top30条代谢途径）

03野生枣与驯化枣代谢产物的变化

      对207份枣树种质的果实进行代谢组定量研究。总共检测到了2985种代谢物，其中有427种代谢物被化学注释，分为12类，包含生物碱、黄酮、糖、脂质、维生素等，这些结果综合反映了枣的营养价值和药用价值。对2985种代谢物的相对丰度进行统计分析，结果表明96.68%的代谢物广义遗传力（H2）大于0.5，84.38%的代谢物的变异系数（CV）大于50%。通过热图展示了野生枣和栽培枣之间的代谢物丰度差异，这种差异也得到了PCA和PLS-DA的的支持。进一步比较影响果实甜度/酸度的代谢物的变化，发现栽培枣中蔗糖、柠檬酸有显著增加，苹果酸和奎宁酸有显著降低。同时，在驯化过程中，几种特殊的代谢物如皂苷、安息香碱等都有显著的降低。这表明，枣树驯化以来，对特殊代谢物的选择比对碳水化合物选择更强。

      对于枣树群体中变异较大的代谢物，可能是由于遗传漂移引起的。通过Qst-Fst比较策略，表明影响酸度的苹果酸被定向选择，这可能也是改善果实口感的决定因素。这些结果表明，定性选择苹果酸，同时选择特殊代谢物，可能会重塑驯化枣的食用特性。

图3 枣树种质的驯化代谢图谱

（A.热图、B.PCA、C.阈值筛选、D.T检验、E.特殊代谢物T检验、F.Qst-Fst检测代谢选择火山图）

04枣代谢物变化的遗传机制

      为了剖析驯化过程中代谢组变异的遗传决定因素，对207份枣进行了mGWAS分析。通过Bonferroni校正后，得到986种代谢物关联的1080个基因，对应9705个SNP位点。对代谢物重要位点进行曼哈顿图展示，在特殊代谢物中发现了重要的联系，如萜类、生物碱和类黄酮，他们可能比初级代谢物有更大的遗传效应。

      代谢产物相关位点并不是均匀分布在基因组上，而是形成了49个潜在热点，与14~100个代谢产物关联。这表明，在热点区域存在对这些代谢途径有广泛影响的关键因素。此外，研究者整合了选择性消除分析和代谢产物相关基因位点，发现了160个显著位点与167个代谢产物重叠，包括三萜、生物碱、有机酸等。在栽培枣中，代表较高的等位基因频率降低。这些结果表明，驯化过程中三萜通路更有可能是选择的重点。

图4 遗传变异分析

（A.mGWAS代谢物、B.重要热点区域、C.三萜类化合物等位基因频率）

05 三萜类物质的负选择是枣驯化的基础

      通过整合基因功能注释、代谢物和等位基因直接的连锁性以及代谢物和基因表达的相关性，进一步确定了每个位点的候选基因。通过筛选，候选基因中最有可能的是7个完整注释的OSC基因。转录本分析表明7个OSC基因中有5个会在枣中以两种明显不同的表达模式，其中3个主要在果实成熟时期表达，这与共定位的三萜类化合物积累方式一致。其中evm.model.Contig63.28含有35个SNP，30个位于启动子区域，5个位于外显子区域，启动子区域的SNP在起始密码子上游形成了一个连锁不平衡块，表明从野生枣到栽培枣，代表高三萜类含量的等位基因频率逐渐降低，该启动子区域的突变可能是野生枣和栽培枣出现三萜类物质差异的重要原因。此外，也对三萜类化合物下游的生物合成路径进行研究，确认了evm.model.Contig66.109是参与三萜类合成氧化的重要酶，参与重建枣的三萜类生物合成途径。

图5 驯化过程中三萜类研究

（A.三萜类变化热图、B.17个三萜类化合物GWAS结果、C.OCS基因簇定位、D.蓬松酸含量、E.等位基因频率、F.OSCs表达图谱、G.4号染色体上核苷酸多样性、H.LD块、I.五环三萜产物表达图谱、J.五环三萜类合成途径）

06干、鲜用品种间环肽生物碱的差异

      对比24种典型干型和31种新鲜类型的代谢物，确定出203种显著差异的代谢物。其中7种环肽生物碱（3个CPAs、4种山参碱）在干用品种中积累较多。通过Qst-Fst分析，发现在基因组水平，3个CPAs的直接选择，是导致干、鲜品种食用特性差异的原因。通过验证发现，CPA可能不是通过环肽形成，而是由前体基因编码的翻译后修饰肽（Ripp）形成。再次对相关位点进行搜寻，筛选出假定候选基因evm.model.Contig42.162，转录本分析表明，其影响枣三七碱的生物合成，发挥甲基转移酶的作用。

      通过Fst及序列验证，从207份枣材料中鉴定出了3种基因型，纯合TT基因组中三七碱F的表达显著高于CC和C/T的，因此T代表更高表达的等位基因，其频率在干品种中83.3%下降到鲜品种的33.8%，这也进一步表明evm.model.Contig42.162极有可能影响CPA的表达。

图6 枣品种分化背后环肽生物碱的遗传基础

（A.代谢差异火山图、B.CPA相关mGWAS曼哈顿图、C.BURP鉴定、D.甲基转移酶结构域基因家族系统发育树、E.evm.model.Contig42.162位点对比色谱图、F.核苷酸多样性、G.不同基因型频率分布）

总结

      重测序分析表明，与碳水化合物和次生代谢合成相关的基因在枣驯化中被高度选择。代谢组驯化分析表明，在驯化过程中特定选择苹果酸，同时选择包括三萜在内的次生代谢物，这些都是产生枣子可食用的特性，而环肽生物碱 (CPA) 在干枣和鲜枣栽培品种之间的积累呈现出显著的差异分化。mGWAS分析揭示了枣驯化过程中三萜含量的减少。代谢组和转录组联合分析解析了枣中熊果酸的合成代谢通路。最后，研究者还鉴定了参与 CPA 生物合成并负责品种间含量差异变化的 N-甲基转移酶基因。总之，本研究为果树驯化过程中代谢物的变化研究提供了新见解。

-小编点评-

      在解析果树驯化机制中，大多数都是基于GWAS和群体进化研究进行的，而将重测序与代谢组数据进行关联分析为果树驯化研究提供了新的视角。其整体思路为：自然群体分群做代谢物差异，mGWAS寻找位点，重点关注控制差异代谢物的位点，通过基因克隆等手段寻找变异调控代谢物的机理；位点比较，进行演化和群体遗传研究；然后再研究代谢物如何影响表现变化。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/tpj.15617