Nature Communications|两个MADS基因共同调控番茄果实的全肉型质地
发布日期：2021-12-16 浏览次数：4612
2021年11月25日，植物学顶级期刊Nature Communications（中科院一区，IF=14.919）在线发表了题为“Interaction of two MADS-box genes leads to growth phenotype divergence of all-flesh type of tomatoes”的研究论文，该研究通过检测12个心室胶状组织类型差异较大番茄品种中SlMBP3的转录水平，发现SlMBP3的表达量高低是心室胶状组织形成的关键要素，并通过ChIP-seq和RNA-seq分析，解析了SlMBP3通过调控细胞周期和细胞扩张影响心室胶状物的形成。该研究为改善番茄和其他肉质水果质地的研究提供新见解。
研究背景
番茄是一种肉质水果，其软化程度和内部结构不仅决定番茄的感官品质和商业价值，也是评判其用于鲜食或是工厂化加工的重要指标。肉质水果组织结构的动力学是复杂的，软化程度一直被视为与成熟过程相关。因此，大量研究试图通过减缓成熟过程来实现对果实软化的控制，但这一操作会导致感官品质的极大下降。
心室组织对果实内部结构至关重要。在一些番茄品种中，心室组织可达总果实体积的59%。心室的形成始于果实发育早期，此时细胞经历分裂和扩张形成薄壁组织。当具有巨大细胞间隙的大细胞经历液化过程时，获得典型的胶状物结构。内部组织结构的自然变异决定了番茄果实的多样化。根据心室组织结构不同，主要分为三种类型：富含胶状物型、类似茄子的全肉型和类似辣椒的蓬松型。其中，全肉型被认为是最适合工厂化加工的品种，深受育种家的追捧。然而，到目前为止，心室分化为胶状物结构的遗传和分子基础仍知之甚少。
自然变异形成多样化的番茄内部组织结构
研究思路
材料：全肉型品种H8204、Gades、TP269、Redsky、TP366和Isi富含胶状物品种AC、MT、MO035、VI002、BA131和PO024
组学思路：RNA-seq+ChIP-seq
研究技术路线
研究结果
番茄果实内部组织结构的自然多样性与SlMBP3基因座内的等位基因变异有关
番茄中SlMBP3表达的下调，会导致富含胶状物的品种Ailsa Craig (AC)转变为无胶状物的全肉型。然而，这种突变会导致许多不利表型，例如生长减缓、果实减小、种子发育受损且完全无法萌发。研究者通过对SlMBP3位点的序列分析发现，全肉型品种中SlMBP3位点的5'-UTR上游77 bp区域有40 bp的缺失，而在富含胶状物的品种中无碱基缺失。荧光定量结果显示，缺乏胶状物的全肉型品种中SlMBP3的转录水平最低，富含胶状物的品种中SlMBP3的转录水平最高。过量表达SlMBP3使得3份材料由全肉型转变为心室组织富含胶状物型，且该转变与花后10天果实硬度开始下降密切相关。
不同番茄材料的心室组织发育和SlMBP3表达水平
SlMBP3（不是SlAGL11）的表达决定心室胶状组织的形成
在番茄中，SlMBP3与其同源基因SlAGL11都属于MADS-box家族的D类。为了阐明SlMBP3和SlAGL11在心室胶状物形成中的功能意义，研究者使用 CRISPR/Cas9或RNAi技术实施基因组编辑策略，并利用甲苯胺蓝染色观察全肉型和富含胶状物类型的心室组织结构及质地差异。在WT果实中，室腔充满胶状物组织，甲苯胺蓝染色较弱或不染色。在SlMBP3-KO果实中，重度染色的室腔组织缺乏典型的胶状物特征，细胞壁厚且清晰。SlMBP3/SlAGL11双敲除植株果实的心室组织与单SlMBP3-KO果实相似，具有较厚的细胞壁，被甲苯胺蓝强烈染色。而过量表达SlMBP3的果实显示出富含胶状物组织，没有被甲苯胺蓝染色。这些数据表明，SlMBP3有助于心室组织从薄壁组织向胶状物的发育。此外，研究者还发现SlMBP3-KO果实中的非胶状组织在花后10天阶段显现，而SlMBP3或SlAGL11过表达的果实表现为萼片转化为肉质器官，并在果实发育早期开始出现极端软化。总之，这些数据支持了果实硬度是在早熟阶段确定的观点，且两种MADS-box家族的D类番茄蛋白可能至少部分拥有一些类似的功能。
SlMBP3和SlAGL11功能缺失及过量表达番茄株系的表型分析
值得注意的是，SlMBP3-KO番茄果实在室温下储存数周时不易腐烂，表现出更高的抗性和更好的货架期。除了延长保质期外，水果的干物质和糖含量也显著增加。这些特征表明，全肉型特性使水果在加工时具有额外的品质。
SlMBP3-KO番茄果实的货架期延长，干物质和糖含量增加
SlMBP3是心室组织发育的主要调节因子
为了更好地解释SlMBP3在番茄果实内部组织分化调控中的作用，作者构建了一系列表达SlMBP3或SlAGL11启动子驱动的GUS报告基因的转基因系。结果显示，SlMBP3的表达在花授粉和结果之前就开始了，而后在心室分化出的胶状物组织、种子和发育果实的珠柄中高表达。与此相反，SlAGL11在花后4天的种子中开始表达，但在花受精前及发育的果皮、心室胶状物和珠柄中不表达。SlAGL11在生长素诱导的无籽果实中不表达，而SlMBP3在生长素诱导的无籽果实胎盘中表达。这些不同的表达模式表明SlAGL11和SlMBP3在种子发育和组织分化中的特殊作用。
SlMBP3和SlAGL11在整个果实发育时期的表达模式
细胞壁相关基因是SlMBP3作用的关键靶点
利用RNA-seq与全基因组ChIP-seq相结合的方法进行全转录组分析，为研究心室组织形成过程中可能涉及的基因和通路提供了新的视角。研究者发现，SlMBP3基因敲除导致6,807个基因在花后10天的心室组织中发生差异表达。在8个受影响最大的功能类型中，与细胞壁相关的基因最多，占总差异基因的46.7%。
这些数据表明，SlMBP3在心室组织形成的早期阶段，调控细胞壁相关基因的表达。免疫沉淀DNA测序显示2363个峰，其中48.2%位于注释基因上游3 kb区域内。MEME-ChIP软件显示，与SlMBP3结合序列最多的区域对应于10 bp的CC(A/T)6GG基序，这与其他番茄MADS转录因子（如RIN、FUL1和FUL221）的已知结合位点一致。考虑到某些基因会产生不止一个峰，ChIP-seq确定的1139个峰对应于1081个假定的基因靶点。整合ChIP-seq和RNA-seq数据，最终确定450个基因是SlMBP3的靶基因，且在SlMBP3-KO的心室组织中显示差异表达。因此，作者认为RNA-seq和ChIP-seq数据共有的细胞壁相关基因是调控SlMBP3-KO果实显著硬度和SlMBP3-OX果实软化的最佳候选基因。
通过整合全基因组RNA-seq和ChIP-seq方法确定的SlMBP3靶基因
接着，研究者对预测的24个与细胞壁相关的SlMBP3靶基因进行热图分析。结果显示，这些基因分为3个不同的分支。第一分支聚集的基因在心室和果皮中高表达，第二分支聚集的基因在果皮中高表达，第三分支聚集的基因，在心室和果皮组织中均有表达，且在心室胶状物中的表达仅限于成熟的早期阶段。而后，分析了作为三个分支代表的九个细胞壁相关基因的ChIP-seq数据，结果显示其中存在高度保守的CArG-box基序的富集峰，该基序为已报道的MADS转录因子的结合位点。该结果进一步表明，9个细胞壁相关基因为SlMBP3的靶基因。
SlMBP3-KO株系中细胞壁相关差异表达基因的表达模式
SlMBP3通过调节细胞扩增和细胞增殖基因影响心室胶状物组织的形成
为了解SlMBP3如何影响心室组织的分化过程，从而产生全肉型（SlMBP3-KO）或液化凝胶型（WT）果实。研究者检测了SlMBP3-KO和WT株系心室组织中细胞类型的变化。数据显示，花后6-9天，过度扩张的细胞开始在WT果实的心室组织中分化，伴随着出现心室胶状物。
SlMBP3-KO与野生型番茄果实心室组织内细胞的性状变异
数据统计结果显示，WT较SlMBP3-KO果实中的总细胞数量更少，且WT心室组织中过度扩张细胞的数量和平均面积都显著大于SlMBP3-KO果实。
总结
本研究证明了SlMBP3通过影响细胞周期和细胞扩张基因的转录，进而调控心室胶状物的形成。进一步确认了果实软化的重要成分在果实发育前期就已经确定。研究成果将为改善番茄和其他肉质水果质地提供基因资源。
小编点评已有报道显示，SlMBP3表达的下调会导致含胶状物的品种Ailsa Craig转变为无胶状物的全肉型，但这种突变会导致生长减缓、果实减小、种子发育受损且完全无法萌发的表型。为什么目前商业化的全肉型品种没有显现小果实和发育不正常的种子呢？此文在此基础上提出疑问，SlMBP3是否是导致全肉型品种缺乏心室胶状物的原因？随后通过多品种比较、关键基因敲除和过表达，最终确认了SlMBP3是调控心室胶状物的形成的关键基因，并且该性状在果实发育的早期就已确定，其与果实的质地和硬度密切相关。最后结合RNA-seq和ChIP-seq分析，系统阐述了SlMBP3通过影响细胞周期和细胞扩张基因的转录，进而调控心室胶状物的形成。这种靶标物种的经济性状，在性状差异较大的品种中进行比较和相关性分析，而后获得调控该性状的关键基因，同时结合组学数据，最后获得系统的性状相关调控网络的研究思路对于经济作物研究具有广泛的普适性，值得我们借鉴。
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