植物线粒体基因组3分文章案例分享：望春玉兰线粒体草图及被子植物线粒体系统基因组学

    本文是深圳仙湖植物园发表在《PLoS One》（Q2=3.240）题为“The draft mitochondrial genome of Magnolia biondiiand mitochondrial phylogenomics of angiosperms”的研究成果。该研究测序了望春玉兰线粒体基因组，通过分析基因组特征、重复序列及重组率，系统发育关系，质体片段转移等研究揭示早期开花植物线粒体基因组的多样性、进化及mt基因组重复介导的重组。本研究为木兰科植物与真双子叶植物、单子叶植物姐妹关系分支提供了证据。

原文链接：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0261196

研究背景

    植物线粒体（mt）基因组大约是动物的100-10000倍，由于重组频繁，其结构更加复杂。基因组大小受基因丰富度、内含子丰富度、细胞核、叶绿体及外源基因整合序列的影响，大小66 Kb-11.3 Mb ，含13-60个编码基因。迄今为止即使两个植物为同一物种的不同材料，也没有相同的基因顺序，这与陆地植物质体基因组的保守结构进化形成鲜明对比。植物mtDNA的结构流动性与重复序列的重组活性有关，如通过反向重复进行的基因组同源重组将导致反转，正向重复将导致主基因组细分为亚环。所以植物mtDNA通常包含主环构象及共存的多种重排的亚环。如果这些结构变异型中的一个遗传给后代，基因顺序可能会在两代内发生改变。这表明重复重组频率和重复长度与物种本身关。一般来说，序列相似性高的长重复序列（>1000bp）更容易重组，中等重复序列（100-1000bp）偶尔重组，短重复序列（<100bp）很少重组。

被子植物约250000种，是陆地植物主要谱系，也是陆地生态系统的主要植被。了解被子植物的核、质体和线粒体的基因组进化，特别是早期分化谱系的基因组进化具有重要意义。四个被子植物mtDNA在许多方面表现出极大的多样性，无油樟长3.9Mb，含绿藻、苔藓和其他被子植物的六种外源mtDNA片段。蓝星睡莲mtDNA有最丰富的重复序列，但只有少数表现出重组。扩大早期被子植物mtDNA取样有助于深入了解被子植物mtDNA多样性和进化。

    最近两个独立的系统基因组及北美木兰属植物核基因组分析导致北美木兰属在分类学上存在争议。北美木兰属植物为真双子叶植物和单子叶植物的姐妹，与质体系统基因组分析一致。北美木兰属植物与单子叶植物和真双子叶植物在质体和核证据之间存在分类学争议，需要通过线粒体系统基因组学进一步验证，利用线粒体系统基因组学分析北美木兰属植物的系统发育位置。

材料和方法

线粒体基因组组装和注释

    从望春玉兰的全基因组中获得线粒体基因组，CTAB法获得总DNA， Oxford Nanopore测序平台测序，深度10X ，以北美鹅掌楸作为参考基因组得到一条 长967,100 bp的conting，然后组装成环。PCGs 和rRNAs通过NCBI Blastn 注释，Geneious software 注释内含子和外显子，tRNAscan-SE 2.0检测tRNAs，Blastn 注释细胞核和质体的同源片段。获得望春玉兰组装的线粒体基因组并上传NCBI 获得登录号MN206019，利用OGDraw 1.2 获得可视化的环状线粒体基因组圈图。

重复和重复介导的同源重组

    从校正的Nanopore reads建立了mt数据库，获得174,003 reads，平均长度 22,527 bp，总长度3,919,721,246 bp。对blast同源性>85%的50-29306bp重复进行重复介导的同源重组，每个重复序列对构建了四个或八个参考序列。

系统发育关系

    NCBI下载82个线粒体基因组，包括24个目，2个裸子植物做外群，81个被子植物（每个属只有一个）；序列为基因组的38个PCGs。

结果和讨论

基因组测序和组装

    测序获得12,836,970 reads，平均长度 13,492 bp，校正获得 5,858,689 reads，平均长度14,839 bp，经过组装获得 995,279 bp 环状DNA 结构。然而，在整个基因组读取映射文件中，拉长区域的覆盖率很低（7×）表明这个假定的环状分子可能是亚环水平上另一种构象。因为植物中存在线性或分支mt基因组，所以决定将mt contig称为望春玉兰mt基因组草案。

基因组大小和基因含量

    线性线粒体基因组 长967,100 bp，GC含量46.6%。望春玉兰较大的基因组与基因间间隔区的扩展有关，间隔区达到890 Kb，占基因组的92%。木兰属基因间间隔子的数量和比例比睡莲属和鹅掌楸属大。基因间间隔区包含重复序列、核和质体转移序列、水平转移序列和来源未知的混杂序列。木兰属共鉴定1145个重复序列，累计长 262 Kb，从核和质体中转移的片段累计大小分别是288 Kb 和 26 Kb。北美木兰属植物与另一个已测序的植物 mt 共享 80% (595 Kb) 的间隔区，共享最多的是鹅掌楸属（Liriodendron）其次是无油樟属（Amborella），接着是五味子属（Schisandra），最后是睡莲属（Nymphaea）。

Magnolia 和 Liriodendron 之间高 mtDNA 共享水平反映了它们相对较新的分化时间。北美木兰属mt基因组编码64个独特基因，分别是41个PCGs，20个tRNAs，3个 rRNAs，基因总长度占mt基因组的8%，PCGs占4%。北美木兰属基因含量与鹅掌楸属、五味子属和睡莲属mt基因组相似。北美木兰属包括25个II类内含子10个中断基因，20 个顺势拼接，5个转剪内含子，这与Liriodendron 内含子一样，与Schisandra、Nymphaea、AmborElla 不一样。总的来说北美木兰属基因组草图包括与现有基因组相似的基因和内含子，说明开花植物最后一个共同祖先的mt基因组可能拥有41个PCGs，其中包含25个II类内含子、20个tRNAs和3个rRNAs。

重复和重组率

    草图有1,145个重复序列，长度超过50bp，占基因组的27%，其中有54%的长重复和中等重复，表明北美木兰属有更频繁的重组。比较特别的是除了表2中17个重复外，没有检测到重组的数据。检测到重组平衡，包括16kb和3kb的两个反向重复和一个29kb的正向重复。长重复序列有高的重组率，反向重复比正向重复更容易重组。重复序列的长度和重组率有关，小于100bp的没有检测到重组数据。线粒体DNA主环构象中正向重复之间的重组可产生两个亚环，反向重复之间的重组可以产生一个反转。通过这些重复序列和其他重复序列之间的重组，北美木兰属主要存在主构象以及其他反转或亚圆形的替代构象。线粒体DNA异质性为进化选择提供更多的遗传物质，在进化中赋予北美木兰属一些生态和遗传适应性。

质体转移的mtDNA序列

    望春木兰mtDNA 包含54个 54 bp- 4 kb质体插入片段，累计长度26kb，占基因组的3%。质体 DNA 转移到线粒体最有可能发生在维管植物的祖先中，质体转移的DNA有时携带质体基因，转移的PCG通常变得无功能，tRNA大多保持功能。mtDNA中注释了六个质体tRNA，分别是trnDGUC-cp、trnMCAU-cp、trnNGUU-cp、trnICAU-cp、trnPUGG-cp、trnWCCA-cp，这些tRNA的转移可以追溯到维管植物的不同进化阶段。trnHGUG-cp和TRNMCAU-cp的转移可能发生在种子植物的共同祖先中，最早在一些裸子植物中，表明tRNA在木兰科和双子叶植物的祖先中获得是同等的。trnDGUC- cp主要存在于一些双子叶植物的mt基因组，单子叶植物和裸子植物中，因此，这种tRNA在北美木兰属和鹅掌楸属出现代表了它们在时间上最早的出现。这表明该tRNA在木兰科和双子叶植物的祖先中获得一次平行，北美木兰属植物与其他被子植物分裂之前作为单一获得事件，随后在单子叶植物中发生谱系特异性丢失。

基因组结构与保守基因簇

    植物mt基因组具有结构动力学特征，需31次重排来协调任意两个的基因顺序。五个植物mt基因顺序比较，北美木兰属基因顺序需要31、34、34和44次重排才能与鹅掌楸属、五味子属、无油樟属和睡莲属的基因顺序共线。每个 mt 基因组中的重复数与木兰相关的三个物种发散时间与重排事件的数量相关。

系统发育推断

    NT数据集由38个蛋白质编码基因组成，总长度达30903 bp，有9541个信息位点，对应于AA数据集中的10301个字符，4153个信息站点。Partitionfinder分别识别了NT和AA数据集的15和9个子集。基于NT数据集的系统发育重建与四个线粒体基因重建的系统发育基本一致。AA数据集产生了一种新的拓扑结构（S4图），并系木兰科和多系木兰藤目，这可能是由线粒体氨基酸高疏水性强选择导致氨基酸水平的同质化。

核苷酸数据集反映线粒体系统基因组学的系统发育。在我们的分析中，ANA一系列差异发生在被子植物系统的基础上，在植物多样化之前。NT数据集分析，单子叶植物和真双子叶植物都有很好的支持，同时支持单子叶植物和真双子叶植物姊妹关系。所有木兰类群形成一个单系群，为94%的BS和1.00 PP支持，这与之前的研究一致。在木兰类中，Canellales是木兰目和樟目的姊妹分支，而不是胡椒目姊妹。可能需要扩展采样来解决木兰类植物内部的关系。与核基因组研究相反，研究恢复了木兰类植物与单子叶植物和真双子叶植物的中度支持姐妹关系，与质体证据一致。因此，细胞器系统基因组学分析倾向于支持木兰与真双子叶植物和单子叶植物的姐妹关系。本研究表明，线粒体系统基因组学是解决被子植物科、目或更高分类等级间关系的信息工具，特别是用于重建古系统发育关系。然而，在目前的分析中，一些深层的节点，如睡莲目和无油樟目的系统发育分化顺序，五个核心被子植物谱系关系并没有很好地解决。

结论

    Nanopore 测序组装了北美木兰属的线粒体基因组，其基因和内含子与睡莲属和鹅掌楸属相似，其基因组相对较大，包含大量重复序列、祖先保留序列和基因间间隔区的核同源序列。尽管大中型重复序列的比例很高，但重组率较低，在北美木兰属线粒体中只有17个重组活性序列，北美木兰属线粒体中的重复重组可能导致 mtDNA 异质性，从而有助于动态结构进化。这项研究为早期开花植物线粒体基因组的多样性、进化及重复介导的重组提供了新见解。研究还为木兰科植物与真双子叶植物、单子叶植物的姐妹关系提供证据。