【叶绿体光系统功能基因】AtpB重编码纠正移码突变使致命突变恢复光自养生长

本文是德国波茨坦大学的马克斯·普朗克植物分子生理研究所Irina Malinova等人发表的题为"Correction of frameshift mutations in the AtpB gene by translational recoding in chloroplasts of Oenothera and tobacco "的文章，利用烟草和月见草突变体展示了AtpB在 I-iota叶中的重编码机制。

期刊：PLANT CELL

IF：11.277（Q1）

原文链接：https://doi.org/10.1093/plcell/koab050

翻译重编码，也称为核糖体移码，它能使核糖体沿着mRNA滑动进而改变合成蛋白质的氨基酸序列。I-iota 是月见草属（月见草）的质体突变体，携带一个腺嘌呤插入到AtpB编码区的oligoA(11A)，这种突变可能会合成一种短的、无功能的蛋白质。AtpB蛋白全长可以在 I-iota叶中检测到，说明存在运行的重编码机制。为描述这一现象，我们制作了一个转质体烟草株系，它们的 AtpB ORF通过删除或插入oligoA motif发生改变。观察到插入两个腺嘌呤比插入一个腺嘌呤或删除一个或两个腺嘌呤更有效。进一步表明均聚物组合物 oligoA伸长对重新编码非常重要，AAG作为AAA赖氨酸密码子的额外替换能导致白化表型。我们的研究为叶绿体翻译重编码提供证据，重新编码可以纠正移码突变，可以在出现致命突变时恢复光自养生长。

质体突变体是分析非孟德尔遗传、光合作用研究和叶绿体基因表达机制分析的重要工具。移码突变除非被转录或翻译更正不然会导致蛋白质功能的破坏。重新编码存在于几乎所有生物体中，但在植物中很少被发现。翻译重编码或核糖体移码——核糖体在蛋白质合成过程中省略核苷酸或沿mRNA模板向后移动的过程，是细菌的典型特征。叶绿体有自己的基因组，进化起源于蓝藻。目前为止，还没有明确的证据表明核糖体移码作用于叶绿体。月见草自发叶绿体突变体I-iota显示出斑驳的叶子，潜在的突变是AtpB基因早期oligoA中的一个腺嘌呤插入，AtpB编码叶绿体ATP合酶的β亚单位。根据遗传编码的标准规则，这种突变会导致蛋白质功能失调。但AtpB蛋白全长在 I-iota 叶中检测到，表明一种校正机制在突变体中起作用。

为了详细地分析这一现象，我们获得了一系列烟草叶绿体突变体。有趣的是，在烟草 [Nt-IM12 (+1A)]中的I-iota 突变与I-iota植物表型相似。此外证实了AtpB合成蛋白的功能。相比之下，在oligoA伸长的 AtpB[Nt-IM14 (+2A)]中插入两个腺嘌呤他们会变绿甚至可以在土壤上生长。这些结果以及对ATP合成酶和mRNA的进一步分析证实Nt-IM14 (+2A) 可通过核糖体移码有效地纠正2A突变，最重要的是它能够恢复光自养生长。

结论和讨论

有效的重新编码需要均聚肽序列

转录滑移的重编码依赖均聚序列，而PRF可发生在均聚物或杂聚物滑移部位。转质体的烟草植株除了移码突变外，oligoA第三密码子位置的腺嘌呤被鸟嘌呤取代，导致植物（[Nt-IM13 (AAG+1A)）白化，表明ATP合成酶完全丧失。大肠杆菌中双荧光素酶分析观察到这些结构物的翻译效率显著降低，说明AtpB中的移码补偿需要均聚物道。

细菌中编码重复赖氨酸密码子（AAA或AAG）的mRNAs在蛋白质合成的效率及准确性上存在显著差异。由于70S核糖体读取AAA和AAG密码子的方式不同，AAG密码子上没有滑动，所以与同义AAG密码子相比，AAA密码子的存在降低了蛋白质表达。这些发现与双荧光素酶分析结果一致，与oligoA伸长的野生型（[pEK4-Nt-WT]）相比，pEK4-Nt-IM11（AAG）的翻译效率有所提高。特别是–2A缺失[Nt-IM18(–2A)] 导致罕见绿斑的白化表型，Nt-IM18（–2A）表型与Nt-IM13（AAG 1A）相似，在Nt-IM18（–2A）中未检测到AtpB肽，表明-2或+1核糖体移码在T-IM18（-2A）中不活跃。因为已知RNA聚合酶的口吃倾向与（均聚物）滑溜部位的长度密切相关，所以A8同源聚合物束也不能有效诱导转录滑移。

已有报道I-iota和烟草转质体表型表现出剂量阈值依赖性，比如具有绿色和白色叶段的拟南芥。根据数据，积累一定量的ATP合酶是绿化所必需的，这与依赖于白/绿表型的类囊体膜形成的发育梯度一致。ATP合酶组装在类囊体形成的很早阶段，但不是最初的步骤。质体中，ATP 合酶（细胞色素 b6f复合体）是第一个完全组装的复合体，而光系统只在光中积累。

在I-iota和转质体烟草株系，什么样的重新编码机制起作用  

 低水平监测区分转录滑移和PRF可能是一个挑战，PRF常形成一种以上的蛋白质，可能是截断的AtpB蛋白不稳定，蛋白质组学分析仅检测到与正确阅读框对应的肽。然而，在NT-IM14（+2A）中发现两个校正的蛋白质变体（–1和+2），为核糖体移码而非RNA聚合酶口吃的操作提供环境支持。预测的mRNA二级结构显示 oligoA延伸下游存在一个stem–loop-type结构，可以作为核糖体的滑动位点。

对各种突变体的cDNA分析评估转录滑移的可能性，未发现NT-IM12（+1A）和I-iota（+1A）转录滑移的迹象，但将 Nt-IM12 (+1A) 或 I-iota (+1A) 与相应的野生型 RNA 混合的掺入实验显示检测限约为 15%，由于帧校正Nt-IM12 (+1A) 低于10%，不能排除Nt-IM12 (+1A)的转录滑移操作。

比较明显的是在质体烟草突变体中，+2A插入oligoA 延伸比+1A插入更能有效地纠正[Nt-IM14（+2A）vs NT-IM12（+1A）。Nt-IM14 (+2A) 混合营养条件下，表型与野生型最相似，可以光自养生长并产生种子。就光合参数而言，Nt-IM14（+2A）表现出介于野生型和Nt-IM12（+1A）之间的中间表型。Nt-IM14 (+2A)中检测到含有两个或三个赖氨酸的AtpB肽，表明存在两种校正模式：+2和–1。其他系统中，已经报道了几个病例，其中两个不同的核糖体移码可能发生在同一位点。在Nt-IM12（+1A），cDNA分析T-IM14（+2A）中没有转录滑移迹象。cDNA敏感性试验中，野生型和NT-IM14（+2A）RNA混合检测到RNA增加5%，另外没有RNA聚合酶口吃，表明纠正发生在翻译水平。微生物系统研究表明，交替解码的效率是高度可变的，从百分之几到百分之八十几不等。大肠杆菌双荧光素酶报告基因分析测定T-IM14（+2A）的移码效率约为40%，在T-IM14（+2A）中测得的ATP合成酶活性，车前草的效率可能较低，是野生型植物的18%。

叶绿体重编码的功能意义

质体基因组同oligoA延伸是突变的热点，细菌基因组中，均聚体域对抗细菌但在内共生体的基因组中保留的频率更高。转录滑移在拯救基因功能方面起着关键作用，聚合酶在均聚束上的口吃是一种突变补偿机制。目前尚不清楚叶绿体是否发生转录滑移，是否补偿移码突变或产生额外的转录多样性。如果发生在AtpB 5’端附近的oligoA延伸处，频率太低无法用灵敏度检测到cDNA。PRF使额外蛋白质产物形成，但也可以在翻译水平上纠正插入。通常，核糖体移码受到严格调控，特异性代谢物和氨酰tRNA供应影响核糖体移码的效率，当在叶绿体中寻找其他可能替代基因解码的情况时，在CEMA（ycf10）基因中发现了一个序列基序。与O. elata、O. glazioviana、O. Parviflora 相反、O. villaricae、O. picensis包含两个ATG密码子，嵌入在cemA.的5’区域内的oligoA 序列中，它俩的oligoA 延伸差3 bp，框架中只有第二个ATG。第一个ATG需要–1 或 +2个移码。与AtpB一样oligoA延伸可以作重新编码的光滑序列基序。一定实验条件下，即使是在基因融合产品中AtpB/AtpE融合，重新编码的效果如何仍然是一个推测问题。

以前植物中重新编码的可能性报告是基于生物信息学预测或间接遗传证据，存在叶绿体中可能是叶绿体细菌历史的遗留物。通过移码对突变的补偿程度上取决于环境条件或叶绿体生理状态，这是未来研究中需要解决的一个有意义问题。