PBJ|高质量的软枣猕猴桃基因组为其抗溃疡病和果实发育研究提供了新见解

2021年11月17日，植物学研究Top期刊Plant Biotechnology Journal（Q1，IF=9.803）在线发表了题为“A chromosome-level genome assembly for the wild kiwifruit Actinidia kolomikta provides insights into canker resistance and fruit development”的研究论文，该研究通过构建高质量的软枣猕猴桃基因组并结合比较基因组分析揭示了其抗溃疡病的分子机制，最后通过转录+代谢分析揭示了其果实发育过程中基因的动态变化，从而为猕猴桃的适应性研究提供了新见解。

研究背景

软枣猕猴桃（Actinidia kolomikta）是我国二级保护植物，除具有较高的营养价值外，其对低温、溃疡病都有极好的抗性，解析软枣猕猴桃的抗性机制对于猕猴桃果实的品种选育和推广利用具有重要作用。该物种的小果实具有酸甜的味道和光滑的绿色皮肤；它们比该属的任何其他物种都含有更高水平的抗氧化剂、维生素C、叶绿素和多酚。本种还表现出对低温的高耐受性和强大的PSA抗性。因此，通过杂交等方法选育猕猴桃新品种是非常重要的潜在材料。

研究思路

材料：软枣猕猴桃

测序策略：PacBio+Hi-C+Illumina

组学思路：基因组+转录组+代谢组

研究技术路线

研究结果

1软枣猕猴桃基因组组装、注释

通过Illumina、PacBio长读测和Hi-C测序，研究者构建了高质量的软枣猕猴桃基因组，其基因组大小为614.16Mb，N50长度为18.2Mb，并将557.93Mb的序列锚定到29条染色体上。使用三种方法分别进行了基因组完整性评估，HISAT2软件比对率为84.29%；CEGMA为93.23%；BUSCO为86.4%；这些结果表明新基因组序列是高质量的。

对重复序列进行鉴定，发现长末端重复序列(LTR)反转录转座子是数量最多的重复元件，占基因组的26.96%；其中有1384个完整的LTR-RTS；注释分析显示软枣猕猴桃基因组共有41660个蛋白编码基因。与中华猕猴桃和毛花猕猴桃相比，研究者在1：1的同源区域鉴定出17088和16,268对共线基因对，这一发现表明猕猴桃和其他两个猕猴桃基因组之间存在很强的共线性。

表1 软枣猕猴桃与其它品种间组装质量的比较

2比较基因组分析

为了探讨软枣猕猴桃基因组的进化关系，研究者利用OrthoMC将其注释基因与其他10个近缘物种的基因进行了聚类，结果表明软枣猕猴桃的29,668个蛋白编码基因(71.21%)聚为18,431个基因家族，平均每个家族1.61个基因，其中519个基因家族为软枣特有单拷贝。进化树分析表明，软枣猕猴桃被归入一个单独的分支，与含有中华猕猴桃和毛花猕猴桃的物种分支相邻其在14.70-31.30百万年前(Mya)存在分歧。进一步在软枣猕猴桃中发现了总共7426个串联重复的基因，比中华猕猴桃(1022个)和毛花猕猴桃(5759个)中的还要多。使用GO对这些串联重复基因的功能富集分析揭示了与抗氧化稳态和应激/刺激反应相关的功能类别。有趣的是，研究者发现串联重复的基因在与细胞壁增厚的防御反应(GO:0052482)和细胞壁中胼胝体沉积的防御反应(GO:0052544)相关的功能中显著富集，这些可能与抗病相关。此外研究者基于共线基因对计算了同义替换率(Ks)分布，结果表明软枣猕猴桃基因组中发生了三个WGD事件。

图1 软枣猕猴桃的比较基因组学分析3软枣猕猴桃的生物和非生物耐受性及相关基因

研究者使用重复过程来鉴定抗病基因，包括富含亮氨酸重复序列的核苷酸结合位点(NBS-LRR)和模式识别受体基因（RLK-LRR）。软枣猕猴桃中共有239个NBS-LRR编码基因，明显多于中华猕猴桃(124)、毛花猕猴桃(160)和拟南芥(214)。软枣猕猴桃基因组中较多的NBS-LRR基因可能是由串联复制引起的。此外，软枣猕猴桃基因组中共有275个可能的RLK-LRR基因，也多于中华猕猴桃(210个)、美味猕猴桃(216个)和拟南芥(203个)的RLK-LRR基因。这些额外的RLK-LRR基因可能同样为软枣猕猴桃高水平的病原菌防御提供了遗传基础。

为了进一步探讨软枣猕猴桃对PSA抗性增强的基因表达变化。比较了高抗(HR)软枣猕猴桃和高感(HS)中华红阳猕猴桃的转录组分析结果表明，软枣猕猴桃和高感(HS)红阳猕猴桃转录组差异显著，在软枣猕猴桃中特异性上调的这些基因主要参与与防御和对各种刺激的反应相关的功能。另外，与中华红阳猕猴桃相比，软枣猕猴桃中上调基因有40个是抗病基因(nbs-lrr和rlk-lrr），14个是软枣猕猴桃特有的基因。这说明，更多抗病基因的进化和表达模式的极大变化可能是软枣猕猴桃对PSA产生高抗性的部分原因。

最后，研究者研究了软枣猕猴桃中指示正向进化的基因是否也与其对生物和非生物胁迫的高度耐受有关，结果表明软枣猕猴桃中有568个正选择迹象的基因，这些基因涉及甲基转移酶、甲基化活性和DNA损伤修复。

图2 多组学揭示软枣猕猴桃抗溃疡病的分子机制4软枣猕猴桃发育过程中基因表达及挥发性代谢产物的研究

研究者分析了四个发育阶段（40-85 DPA）（A-D阶段）和五个成熟阶段（1-5 DAH）转录组数据，软枣猕猴桃转录组的表达谱被分成10个具有不同动态(I到X)的簇。结果表明，E期可能是果实发育到成熟过程中基因表达的关键时期。同时对9个发育阶段进行了挥发性代谢组分析。同样发现早期成熟阶段（E）对于挥发性物质的生产至关重要。在软枣猕猴桃的挥发物中共检测到75种化合物。大多数挥发物的相对丰度遵循发展趋势。包括酚，醛和杂环化合物的代谢物优先在A-E阶段积累，而从F到I阶段酯积累到高水平。

为了进一步探讨果实发育过程中挥发性代谢物中含量最丰富的两类物质(醛类和酯类，占挥发性代谢物总量的62%)的积累与基因表达模式的相关性，对挥发性物质和转录组数据进行了共表达分析。含有辛酸乙酯(CAS：106-32-1)、庚酸乙酯(CAS：106-30-9)和乙酸苯乙酯(CAS：103-45-7)的酯类化合物有10个显著相关基因。其中，Kolo04259(AFB2)与辛酸乙酯和庚酸乙酯呈正相关，并在E期高表达，表明Kolo04259可能参与了这两种物质在果实成熟早期的合成。与2-苯乙酸乙酯显著相关的5个基因也在果实成熟早期高表达，且在此期间物质含量显著增加。这表明这些基因可能参与了早熟期2-苯乙酸乙酯的合成。

所有这些挥发性物质含量的动态变化趋势与最显著相关基因的表达水平相一致。特别是簇II的8个基因参与了脂肪酸的生物合成，脂肪酸是水果香气成分的主要前体物质。此外，根据与显著挥发性香气物质的共表达分析结果，这些物质与主要与酯和醛的产生有关的基因呈正相关。

图3 猕猴桃果实动态发育过程研究

总结

本研究组装了一个染色体水平的参考基因组，基因组大小为566.8Mb，杂合度约为2.13%。总共注释了41，660个蛋白质编码基因。作者发现了与抗病相关的基因家族的明显的物种特异性扩增，并发现经历了正向进化的基因参与了生物和非生物胁迫的抗性。所有这些遗传变化可能解释了这种野生猕猴桃的高抗溃疡病性。此外，作者还分析了该物种果实发育不同阶段的27个转录组和75个挥发性代谢产物，测定了特定代谢物的相对含量和果实发育过程中基因表达的相关变化，并确定了可能导致独特果实风味的关键基因及其来源。这里展示的软枣猕猴桃基因组为利用这种野生植物培育新的猕猴桃品种提供了有价值的遗传基础。

小编点评

由于很多果树具有重要的研究价值，因此经常在实际研究中会遇到被别人“抢发”研究成果的问题。在面对此类现象时，本研究及时转换思路，一方面通过比较自己研究物种与他人研究材料的基因组与转录组差异，另一方面通过多组学分析来解释这种差异，从而获得了高分期刊的青睐。因此，产生数据固然重要，但学会挖掘和分析数据能使组学研究更上一个台阶。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13748