藻苔完整质体基因组序列：苔藓中最大基因集合及RNA编辑的进化观点

文章简介

本文是2021年11月24日发表在 《Plant Molecular Biology 》（IF:4.076）的文章。主要内容是通过比较苔藓植物质体基因组结构，获得陆地植物质体基因组早期进化的信息，系统发育分析不同深层系统发育信息。利用转录组数据确定质体基因组的编辑位点，并提出一个新假设：从进化角度分析单质体营养组织的出现与陆地植物早期分化群质体基因组中RNA编辑密集之间密切关系。

原文链接：https://doi.org/10.1007/s11103-021-01214-z

研究背景

苔藓有900多个属，约13000种，构成了苔藓植物中最丰富的类群。Goffinet等人将其分为八类：Takakiopsida、Sphagnopsida、Andreeopsida、Andreeobryopsida、Oedipodiopsida、Polythrotopsida、Tetraphidopsida、Bryopsida。苔藓纲包括约98%的苔藓物种。Takakiopsida、Sphagnopsida、Andreeopsida、Andreeobryopsida是早期不同的苔藓类群，Takakiopsida是其他现存苔藓的姐妹谱系。Takakia由于其配子体特征引起研究人员的注意。因为与一些苔类、苔藓类、角草类和石蒜类植物部分形态相似性使其在Takakia 系统位置引起争议。该属特征（1）无叶根茎芽，其他苔藓中不存在，但早期分化的Haplomitrium Nees有；（2）颈卵器细胞呈六行垂直排列；（3）Takakia特有的非扁平、棒状叶子；（4）苔藓植物四或五条染色体；（5）顶端细胞和周围的衍生细胞只有一个或两个叶绿体。随后的分子系统发育分析证实了Takakia是一种苔藓，可能与泥炭藓组成一个分支，泥炭藓是所有其他苔藓的姊妹。整个质体基因组装配提供了另一种系统发育信息。虽然陆地植物质体基因组的结构相当保守，但也报道了各种类型的修饰，例如在特定位点的反转、IR区域的扩张或收缩、基因丢失、内含子丢失。质体基因组特征是物种或谱系特异性系统发育标记。Takakia质体基因组以及未来产生的其他谱系分析可以为解决苔藓植物的深层系统发育提供证据，这有助于阐明苔藓植物祖先的质体基因组结构。

RNA编辑是一个转录后过程，它改变mRNA序列，可能导致翻译的蛋白质与DNA序列预测的蛋白质不同。RNA编辑首先在Trypanosoma brucei线粒体中发现，并且在不同的生物体中发现了各种类型的RNA编辑。陆地植物中已在线粒体和质体基因组种鉴定。陆地植物的质体基因组中，RNA编辑通常涉及C-U的转换，然而在一些角草纲及蕨类植物质体中检测到U-C的突变。种子植物质体基因组中RNA编辑位点的数量保持相对稳定，通常为26-54个位点。然而苔藓植物的RNA编辑位点是多样的，从 Marchantia 零位点到Anthoceros formosae 近1000位点不等。

本研究提供了T. lepidozioides完整质体序列，研究目的是通过比较苔藓植物质体基因组结构，获得陆地植物质体基因组早期进化的信息，以及与分子系统发育分析不同的深层系统发育信息。此外，利用转录组数据确定质体基因组的编辑位点，并提出一个新假设：从进化分析，单质体营养组织的出现与陆地植物早期分化群（Takakia、角草、lycophytes）质体基因组中密集的RNA编辑之间密切关系。

材料和方法

DNA提取和测序

Mt. Norikuradake, Gifu Prefecture, central Japan采集样本，凭证标本存放在广岛大学植物标本室。根据已发表的四种苔藓植物的质体组序列，设计引物组，用6-15kb的重叠PCR片段扩增整个质体基因组，引物序列列表见补充表S1。使用 MinElute Gel Extraction kit或NucleoSpin Gel、PCR Clean-Up纯化扩增引物。通过sanger对每个扩增子进行部分测序，并用BLAST搜索以确认目标区域已成功扩增。使用Takara Dragon Genomics（日本）454 GS FLX系统（Roche）和BGI公司的HiSeq 2000（Illumina）对纯化扩增子混合物进行测序。Hiseq 2000获得1775692条 reads ，GS FLX获得31577 条reads 。通过单个PCR和sanger测序对单拷贝和IR区域之间的剩余间隙连接进行测序，获得完整的环状质体基因组。通过与其他苔藓植物的完整质体基因组进行比较，使用GENETYX的 Local BLAST对序列进行注释。

RNAseq和数据分析

RNeasy Plant mini kit 提取总的RNA，构建Illumina的单链RNA序列库，并在BGI上测序，数据量为5G。顶链数据中的明显CT替换对应于顶链转录本中的C对U编辑，而底链中的GA替换对应于底链转录本中的C对U编辑

系统发育分析

选了16份苔藓植物进行分析，14种苔藓类，地钱、角草为外群。用44个蛋白质编码基因构建BI和ML发育树。

结果

显微观察叶绿体

Fig. 1 Takakia  lepidozioides 各种组织中观察到的单质体

光学显微镜下观察每个组织的叶绿体，营养组织的每个细胞通常包含几个叶绿体。然而，根茎顶端的顶端细胞 (Fig. 1B)及幼叶的顶端细胞（ (Fig. 1C)）只有一个或两个叶绿体，根茎芽上的腋生粘液毛也只有一个叶绿体 (Fig. 1D)，颈卵器细胞也只有一个或两个叶绿体 (Fig. 1E)。

基因组结构

Fig. 2 Takakia lepidozioides基因组圈图

T. lepidozioides为环状DNA分子，长149,016 bp，典型的四分结构：大小拷贝区，反向重复区，GC含量 37.07%，是苔藓和苔类中最大质体。Takakia质体含有88个CDSs，32 个 tRNAs、4个 rRNAs、 2个ORF、1个假基因。但其他藓类植物（泥炭藓除外）质体中仅含82或83个蛋白质和31个tRNA。Takakia和角草的基因间区，特别是ycf2-trnD、trnE–trnT和ndhC–trnV之间的区域大于其他苔藓和苔类植物 (Table 2)。

Fig. 3比较六种质体基因组中LSC两端的大小、结构、基因排列

Takakia包含苔藓中最大的基因集合(Table 2, Fig. 4)，编码ccsA、cysA、 cysT、petN、rps16、rpoA、trnPGGG的七个基因在其他苔藓质体基因组中缺失。此外，推测在大多数胚植物中丢失的 tufA 基因座作为假基因保留在Takakia中。除了LSC区域的71 kb倒位，一些苔藓和角草IRs的扩展，苔藓植物质体基因组中基因排列高度保守。Takakia的质体中没有影响基因顺序的结构重排(Fig. 3)。

RNAseq识别编辑位点

将编辑位点的位置与注释进行比较，620个和500个位点分别分类在H链和L链的基因上 (Table 3)。在psa、psb、atp、rpo基因以及ndhF基因中观察到高水平的编辑。

内含子实验证据

使用Trinity assembly数据库提取潜在的质体转录本。比对验证了内含子在petB、petD、atpF、ndhA、nDBB、rpl2、rpl16、rps12、rps16、rPP1、clpP、ycf3、ycf66中存在（Table 1）。

分子系统发育分析

Fig. 4基于 44个PCG构建ML系统发育树

进化树推断Takakia是其余苔藓姊妹 (57%, Fig. 4)；Sphagnopsida（(Eosphagnum nigescens、Sphagnum palustre）形成第二分支；Polytrichopsida 与 Tetraphidopsida形成姐妹群 (83%)，作为第三分支；其余物种形成了一个分支对应于 Bryopsida（100%）。在Bryopsida内五个亚类分别对应于Buxbaumiidae、Diphysciidae、Funariidae、Dicranidae、Bryidae。苔藓科内顺序关系反映了Splachnales、Bryales、Orthorichicales、Hypnales的分支顺序。

讨论和结论

苔藓质体基因组中最大的基因集及系统发育意义

T. lepidozioides 特有基因为ccsA, cysA, cysT, petN, rpoA、rps16、 trnPGGG 推测在大多数胚胎植物中丢失的tufA 作为假基因保留。这些基因在其他藓类植物质体基因组中部分或大部分缺失。苔藓植物的多样化和基因丢失似乎是常见趋势(Table 2 and Fig. 4)。

Takakia质体中有最大的基因集合，先前研究已经指出Takakia质体基因组的几个显著特征，如ITS3中发现了一个27 bp的插入片段，该片段在其他苔藓中不存在，但在其他所有陆地植物中。本研究也发现了这种插入，ccsA、petN和rpoA保留在单倍体中 (Table 2 and Fig. 4)。这些结果表明苔藓、苔类和角草纲的共同祖先具有这些基因。

除了以上八个基因外，角草纲和苔类（liverworts）还有独特的质体基因组结构，具有潜在的系统发育信息。例如角草纲质体基因组中IR区域基因含量在主要谱系中存在结构差异，陆生植物中常见matK、rps15和rpl2，在角草纲植物系统发育谱系中是假基因，在爪哇裸蒴苔有一个重排的SSC和一个重复的nadF。下面讨论链状植物八个基因 (Table 2)的系统发育分布及系统发育信号的有用性。

ccsA

ccsA编码血红素附着到c-type cytochromes 所需的蛋白质，它位于质体基因组的SSC区，在所有光合植物中几乎是保守的。然而ccsA在四齿藓属、苔藓、Aneura mirabilis、寄生种子植物青冈寄生属中缺失。ccsA在Takakia 和Sphagnum 中存在表明基因丢失发生在周气孔苔藓分化之前 (Table 2)。

cysA 和 cysT

cysA 和 cysT在轮藻、中胸气门、Chlorokybus、角草、Anthoceros、Nothoceros 编码硫酸盐转运系统的膜相关ATP结合蛋白，但在一些苔藓和维管植物中却没有。它们通过链状植物进化而丢失或假基因化了几次。63种苔类植物调查显示，在苔类植物整个进化过程中cysA至少消失29次。植物中即使没有硫酸盐转运系统基因也能合成半胱氨酸，表明核编码的质体转运肽蛋白质是将硫酸盐导入质体中。在Takakia中以ORF形式存在，这是cysA、cysT在苔藓质体基因组的首次报道。

petN

petN编码细胞色素b6-f复合物的一个成分，在所有链状植物中几乎保守。在早期分化的Takakia、Sphagnum、Tetraphis、Pogonatum、Buxbaumia中作为功能基因或假基因，但在bryopsid mosses中缺失(Table 2)。

rpoA

rpoA编码叶绿体RNAP α亚单位，在链状植物中几乎保守。但Sugiura等人发现rpoA在Physcomitrium 缺失，基因已被转移到核基因组中。此外在四种 Bryopsid mosses中也缺失，早期在Takakia 和 Sphagnum中是存在的，表明rpoA基因丢失至少发生两次。

rps16

在绿藻中tufA 编码蛋白质合成延伸因子Tu，且只在陆地植物的核基因组。ΨtufA在psbE 和 petL 之间。研究表明tufA存在核基因组中，在叶绿体基因组中进行了假基因化。原生质体tufA缺失发生时间远远晚于核拷贝增加时间；丢失程度在不同谱系中有所不同，在 Zygnematales、角草、liverworts、mosses等多个谱系中独立完成。

trnPGGG

trnPGGG在链状植物质体中表现为一种不寻常的进化模式，在Mesostigma、Chlorokybus、Chara、Staurastrum中缺失，在Klebsormidium、Chaetosphaeridium、Mesotaenium、Zygnema、Roya 中以功能基因形式存在。苔藓中由于反密码子的突变，trnPGGG在Takakia中功能保持完整，在Tetraphis中丢失，在Physcomitrium和Syntrichia中假基因化。这些表明trnPGGG基因在整个链状植物进化过程中多次丧失功能。

Takakia的系统发育位置

Takakiopsida和 Sphagnopsida之间的系统发育关系一直存在问题，已确定了三种系统发育假说：（1）Takakia与所有其他苔藓是姐妹关系；（2）Sphagnum与其他苔藓是姐妹关系；（3）Takakia 和 Sphagnum是其他苔藓分支姐妹。基于44个蛋白编码基因的ML推断支持Takakia姐妹假说（57%），这与Liu等人的质体系统发育不同。此外，基因选择对叶绿体数据重建深层系统发育重要，该拓扑结构基于44个蛋白编码基因支持Takakia姐妹假说。

RNA编辑过程中，基因组DNA突变在转录过程中得到纠正，由此产生的mRNA序列与DNA预测的不同，所以在系统发育分析中提供了不同的系统发育信号。最近利用基因组和转录组衍生数据的混合数据矩阵进行系统发育研究表明：细胞器基因组的RNA编辑位点可能误导系统基因组构建。RNA编辑位点的存在是否会损害系统发育分析结果或作为系统发育信号一直备受争议。考虑到基因组DNA中RNA编辑位点包括进化信息且不引入同源性，我们使用基因组序列进行系统发育分析。

Takakia质体数据提供基因含量和排列信息，这些是系统发育信号。分析苔藓植物，在 Anthoceros 中含有cysA、cysT、rps16，但Eosphagnum、Sphagnum及其他苔藓植物中缺失，tufA 在Anthoceros、Haplomitrium中缺失，在 Takakia作为假基因，在Sphagnum中作为功能基因。基因丢失研究(Fig. 4)表明苔藓植物的最后一个共同祖先拥有上述所有基因，tufA在Takakia中作为假基因，其他苔藓植物丢失了至少3个基因。

RNA编辑

基因组和转录本比较表明，至少有1100个位点进行RNA编辑(Table 3)，所有位点都进行了C-U突变。在角蒿中，除Leiosporoceros和一些枸杞属植物，其他质体中的RNA编辑位点与Takakia相当。Takakia、角草、lycophytes 共同特征是分生组织中每个细胞都有少量质体，这种单质体似乎是早期陆生植物共有的特征。虽然已证明分生组织细胞和造孢细胞是单质体细胞，但在Takakia中单质体细胞存在于各种组织中 (Fig. 1)。

植物细胞器中RNA编辑的进化起源及功能和分子机制一直存在争议。绿藻的可用数据表明RNA编辑在陆地植物群祖先中并不存在，细胞器中的RNA编辑可能是早期陆地植物进化过程中进化而来。大约4亿到5亿年前，最早的植物迁移到陆地栖息地，强紫外线辐射下可导致DNA分子受损。

Grosche等人提出陆地植物细胞器中的RNA编辑已进化为补偿突变，这与适应恶劣的陆地环境有关。早期分化陆生植物的每个营养细胞中质体群体规模较小，这可能导致质体基因组突变的频繁固定，有害突变可通过转录水平上的RNA编辑得到持续补偿。Takakia、角草、lycophytes和蕨类植物密集的RNA编辑位点可能是早期陆地植物进化的痕迹。

新获得的编辑位点是否通过进化而固定取决于遗传漂变和自然选择。当有害突变因基因漂移而占主导地位时，如果RNA编辑可以补偿突变，它将固定在质体基因组中。在Takakia中如果顶端细胞单质体获得RNA编辑位点，它们将传递给所有后续衍生物的质体中，因此在所有细胞中共享。

苔类植物中，不同的谱系中质体RNA编辑位点的丰度差异很大，可以找到几十到几百个，但在复杂的叶状苔中没有一个。苔类植物门也有单质体造孢细胞，这是苔类植物的特例。苔藓植物中单质体细胞的分布模式与RNA编辑位点的频率之间存在明显的相关性，这表明细胞内质体的群体规模对质体RNA编辑进化有重要影响。

尽管苔藓植物质体遗传转化的例子很少，但最近开发的遗传转化DNA工具包在多种植物中发挥作用。未来，单质体植物的质体遗传转化可通过追踪转化的质体基因组证明细胞内质体数量对质体基因组遗传漂移的影响。

Takakia质体基因组包含苔藓中最大的基因集合，保留了苔藓质体基因组中的祖先特征。ccsA、cysA、cysT、petN、rpoA、rps16、tufA、trnPGGG可作为苔藓早期多样性系统发育分析的有用分子标记，同时发现单质体细胞的出现与质体基因组中密集的RNA编辑位点密切相关。营养组织细胞中质体的群体规模可通过长期进化引起RNA编辑位点的积累。