Nature | 低剂量的二甲双胍通过PEN2靶向溶酶体AMPK途径
发布日期：2022-03-18 浏览次数：5062
Nature | 低剂量的二甲双胍通过PEN2靶向溶酶体AMPK途径
简介：
2022年2月23日，国际性期刊Nature（IF=49.962 ）发表了题为“Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2”的研究论文，该研究通过探究二甲双胍的直接分子靶标，发现PEN2是二甲双胍的分子靶点。二甲双胍结合PEN2并启动信号传导途径，该信号传导途径通过ATP6AP1与葡萄糖传感途径交互，激活溶酶体AMPK途径。这确保了二甲双胍在患者的治疗中充分发挥治疗益处而不会产生实质性的不良反应。PEN2-ATP6AP1轴为筛选二甲双胍的替代品提供了潜在的靶标，二甲双胍可用于更广泛的组织，如肌肉，从而在治疗糖尿病和其他代谢疾病方面产生更好的疗效。
研究背景
二甲双胍是降低 2型糖尿病患者血糖水平的常用首选药物，在临床上还具有其他良好效果，例如减轻体重和减少肝脏脂肪含量。另外，二甲双胍可以降低服用该药物的糖尿病患者的癌症发病率。将二甲双胍施用于各种生物体，包括线虫（C.秀丽隐杆线虫）和小鼠，可以延长其寿命和健康期限。
目前已有多个研究提出二甲双胍发挥作用的各种机制，在已确定的二甲双胍的各种潜在效应因子中，代谢稳态的主控制器 AMPK 受到广泛关注。AMPK 通过磷酸化乙酰辅酶 A 羧化酶 1 （ACC1） 和 ACC2，可以减缓已给予慢性二甲双胍治疗的糖尿病小鼠肝脂肪变性和动脉粥样硬化。十二指肠激活AMPK对于 L 细胞中 GLP-1 的分泌至关重要，同时也是口服二甲双胍发挥急性降糖作用的必要条件。此外，二甲双胍介导的C.秀丽隐杆线虫的老化延缓也是通过 AMPK 依赖性机制实现的。
目前人们普遍认为，二甲双胍通过抑制线粒体电子传递链的复合物Ⅰ来激活AMPK，这会抑制ATP合成进而增加AMP/ATP、ADP/ATP的比值。但有报道表明，服用标准临床剂量的二甲双胍不足以增加AMP/ATP、ADP/ATP比率，能量水平的降低只能在高剂量二甲双胍的峰值浓度下观察到。因此，有必要对临床相关剂量的二甲双胍如何激活AMPK进行进一步探索。
研究思路
l 亲和纯化分析溶酶体蛋白提取物，确定二甲双胍潜在分子靶标PEN2
l 差示扫描量热测定法、等温热法、表面等离子体共振、亲和纯化、质谱法等方法研究PEN2与二甲双胍结合位点
l 研究二甲双胍与PEN2结合作用的下游靶点，最终筛出ATP6AP1
l 确定二甲双胍调控AMPK的完整路径
l 动物模型中的表型探索
研究结果
1. 二甲双胍激活AMPK而不增加AMP/ADP水平
之前有研究已经表明，二甲双胍抑制溶酶体中的空泡型H+ -ATP酶（v-ATP酶）。使用低剂量的二甲双胍处理可以使小鼠原代肝细胞中的溶酶体脱酸。同时，浓度低至5μM的二甲双胍可以有力地抑制v -ATP酶并激活人或小鼠原代肝细胞中的AMPK，检测溶酶体传感器的相对荧光强度可以发现其在二甲双胍处理下显著降低。
在指定的时间段内用5μM二甲双胍处理细胞，通过免疫印迹来分析AMPKα以及ACC的磷酸化水平，发现显著上升。通过质谱方法对AMP/ATP、ADP/ATP比率以及AMP、ADP 、ATP的绝对浓度进行分析，发现AMP、ADP浓度保持不变。此外，通过对小鼠进行一系列剂量的二甲双胍处理，在小鼠血液中检测到平均浓度为15μM的二甲双胍，同时在小鼠的肝脏中检测到了AMPK的激活，而AMP/ATP、ADP/ATP的比率保持不变。细胞与动物实验体现了一致性的结果，临床剂量的二甲双胍可以激活AMPK而不改变AMP或 ADP浓度。
2. PEN2与二甲双胍结合是低剂量二甲双光诱导的AMPK活化所必需的
通过基于亲和力的方法，使用光活性二甲双胍探针（Met-P）分析溶酶体的蛋白质提取物，亲和纯化拉下来的偶联物通过质谱进行分析，来确定二甲双胍的直接分子靶标。敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中的113种蛋白，观察到PEN2的敲除降低了二甲双胍的疗效并会阻断低剂量二甲双胍诱导的AMPK激活和v-ATP酶抑制。随机光学重建显微镜和基于APEX标签的透射电子显微镜成像结果显示出PEN2的一部分被定位在溶酶体上，二甲双胍没有改变PEN2的亚细胞定位，表明PEN2参与二甲双胍诱导的AMPK激活。接下来又对与Met-P偶联的PEN2进行质谱分析，并进行计算机模拟，结果表明，二甲双胍通过PEN2的N端的F35和E40残基与其结合，最终确定了PEN2与二甲双胍的结合位点。
3. ATP6AP1将PEN2与v-ATP酶结合在一起来激活AMPK
通过免疫沉淀方法鉴定出ATP6AP1为PEN2的相互作用蛋白。ATP6AP1是v-ATP酶的组成成分，在与二甲双胍结合后，溶酶体PEN2被招募到v-ATP酶复合物的ATP6AP1中，PEN2对ATP6AP1的亲和力抑制v-ATP酶，激活AMPK。根据之前报道显示，葡萄糖匮乏可以通过v-ATP酶、Ragulator和AXIN来激活溶酶体AMPK并且不会增加AMP/ADP水平。敲除AXIN、LAMTOR1（Ragulator的亚基）或者v-ATP酶中的vOc亚基会阻断低剂量二甲双胍对AMPK的激活，这说明PEN2和ATP6AP1通过调节v-ATP酶来对下游AXIN和LAMTOR1进行调控。总体而言，PEN2–ATP6AP1共同将二甲双胍的信号作为相交分流器传递，以抑制v-ATP酶，引发AXIN和LKB1的溶酶体易位到溶酶体表面进行磷酸化和AMPK的活化。
4. PEN2和ATP6AP1是二甲双胍生物效应所必需的。
接下来对PEN2和ATP6AP1在动物模型中介导的二甲双胍的有益效用的功能进行了探究。使用肠道特异性敲除PEN2（PEN2-IKO）小鼠观察到二甲双胍餐后降糖作用受损；同时，二甲双胍对GLP-1和胰岛素分泌的促进作用受损；PEN2的肝脏特异性敲除引起肝脏中AMPK激活强烈损伤；给予二甲双胍以降低肝脏甘油三酯（TAGs）水平和高脂肪饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠的葡萄糖耐受的效果也收到损害。另外，研究团队还测试了二甲双胍诱导的寿命延长是否取决于PEN2和ATP6AP1。敲低PEN2阻断了二甲双胍诱导的C.秀丽隐杆线虫寿命延长的作用；同样，在AP6AP1-/-线虫体内表达哺乳动物ATP6AP1Δ420–440损害了二甲双胍诱导的AMPK激活和寿命延长效应。最后，研究团队研究了含有0.1%二甲双胍饮食的影响，结果表明这种饮食可以通过激活AMPK来延长小鼠寿命并且延缓衰老。总体来说，PEN2和ATP6AP1共同负责二甲双胍的三个主要生物学功能：降低葡萄糖水平、降低肝脏脂肪含量和延长寿命。
总结
该研究表明PEN2是二甲双胍的靶标。PEN2与ATP6AP1亚基结合并抑制v-ATP酶的活性而不增加AMP或ADP，然后激活溶酶体AMPK。因此，PEN2–ATP6AP1 轴构成与溶酶体 v-ATP 酶–AXIN–AMPK 轴相交的信号分流器，这使得低浓度的二甲双胍能够利用 AMP 非依赖性 AMPK 激活途径。这一发现强调了v-ATP酶作为溶酶体AMPK激活的信号节点的重要作用。研究还表明，PEN2–ATP6AP1 轴是二甲双胍的三个主要有益作用所必需的：餐后葡萄糖减少、肝脂肪减少和寿命延长，所有这些都严格依赖于 AMPK。
点评
二甲双胍作为医药界“神药”，除了原本治疗2型糖尿病的经典用途以外，近几年各种研究论文表明二甲双胍不仅能治疗糖尿病，在心血管保护、抗肿瘤以及抗衰老中都有显著作用，不仅如此，网络上对二甲双胍的吹捧更加神乎其乎。但即使是“神药”，也需要理智对待，充分了解其治疗效果的详细作用机制。因此，研究二甲双胍直接靶向分子以及下游调节路径对于了解二甲双胍的实际疗效具有重要意义。这篇文章首先通过亲和纯化以及质谱分析发现了二甲双胍结合靶点，之后以此为基础发现PEN2-ATP6AP1轴作为下游组分构成了二甲双胍激活AMPK途径的完整通路。PEN2-ATP6AP1轴为筛选二甲双胍的替代品提供了潜在的靶标。该项研究也将为二甲双胍应用于更广泛的组织，从而在治疗糖尿病和其他代谢疾病方面产生更好的疗效做出了极大贡献。
（DOI）：10.1038/s41586-022-04431-8.
