Nature Communications|仿生水凝胶为乳腺肿瘤类器官的启动和生长提供支持

Nature Communications|仿生水凝胶为乳腺肿瘤类器官的启动和生长提供支持

（简介）

       2022年03月18日，综合类期刊Nature Communications在线发表了题为“Biomimetic hydrogel supports initiation and growth of patient-derived breast tumor organoids（仿生水凝胶为乳腺肿瘤类器官的启动和生长提供支持）”。这项研究利用一种纳米纤维水凝胶（EKGel）来辅助肿瘤类器官生长，提高其维持质量，为类器官这一种良好的临床前模型提供技术支持。

（研究背景）

       乳腺癌是一种在全球范围内最常见的女性人群癌症，其发病率和死亡率都很高，因为缺乏有效的临床前模型来概括体内乳腺肿瘤的复杂性和异质性特征，基础性研究的发展受到了很大阻碍。在过去的很长一段时间，对乳腺癌的研究主要依赖于只有几十个克隆细胞系的二维培养；发展到今天，将人类肿瘤片段直接移植到免疫功能低下的小鼠体内的患者衍生异种移植物(PDX)，因其在很大程度上保留了乳腺癌的形态学、基因组谱和肿瘤内异质性，成为基础和转化乳腺癌研究的金标准，但仍存在伦理、时间长、效率低等问题。患者衍生的肿瘤类器官(PDO)是从癌症患者组织在三维矩阵中生长的亚毫米三维多细胞结构，已成为一种可以弥合永生化细胞系和PDX模型之间的差距的有前途的模型。PDO的应用依赖小鼠肿瘤基底膜提取物(BME，一种由层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、蛋白聚糖和生长因子组成的凝胶状混合物)，但BME的机械性能难以改变、批次差异大、宿主细胞污染等问题也会制约其发展。因此，应用一种新型材料作为乳腺癌肿瘤类器官的支持物变得非常重要。

（研究思路）

       l 仿生纳米纤维水凝胶的制备

       l PDO培养特性比较

       l 类器官组织学比较

       l 乳腺癌类器官的基因表达

       l 药物反应测试

       l 类器官启动验证

（研究结果）

01 仿生纳米纤维水凝胶EKGel特性概述

       仿生纳米纤维水凝胶（EKGel）由明胶和棒状醛改性纤维素纳米晶体(a-CNCs)合成，明胶提供存在于天然ECM蛋白中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸整合素受体结合基序，从而促进细胞-基质相互作用，而棒状a-CNC的组装导致EKGel的纳米纤维结构。EKGel由纤维网络组成类似于体内肿瘤ECM中的胶原蛋白结构，与BME相比，EKGel中显着更大的孔隙增强了对流驱动的营养物质、废物和药物通过EKGel基质到肿瘤类器官的运输。EKGel的共价交联导致水凝胶稳定性增强。图1e显示了在96μm/s的细胞培养基连续流动下EKGel和BME体积的减少，EKGel适合用于包含生理流的微流控芯片上类器官平台。

02  乳腺癌类器官在EKGel和BME培养特性比较

       为了启动PDO的生长，将分离的乳腺癌细胞封装在EKGel或BME中。方法是将细胞悬浮在水凝胶前体悬浮液中凝胶化2小时，将载有细胞的水凝胶覆盖有乳腺癌类器官培养基，并将细胞培养2-3周，EKGel和BME中的PDO长成由球形细胞簇组成的类器官。从定性角度观察，在BME和EKGel中从三个系中生长的PDO具有相似的外观；荧光颜色显示形成的PDO在细胞表面表达人EpCAM；细胞核对Ki67染色呈阳性，表明在培养>2周后存在活跃分裂的细胞；另外，粘着斑或细胞骨架组织的数量上没有观察到质量差异。

       为了定量表征EKGel和BME中的PDO生长，监测了类器官直径和细胞增殖的时间变化。在EKGel和BME中生长的PDO的直径之间没有观察到统计学上的显着差异，每条线的类器官直径在四个通道中保持一致，表明EKGel适用于乳腺PDO的长期通道和维持。乳腺癌类器官在EKGel中可以正常生长增殖，和在BME中培养相比，增殖特性并无改变。

03  EKGel对PDO形成的和BME具有同样的肿瘤和类器官组织学的适用性

       在最佳条件下，PDO应概括其亲代肿瘤的组织学特征并维持临床相关生物标志物的蛋白质表达。为了进一步探索EKGel对PDO形成的适用性，对在EKGel和BME中生长的类器官的组织学和生物标志物免疫染色进行了分析比较。在所研究的所有样本的组织切片中，在EKGel和BME中生长的PDO看起来同样形成良好，并显示出高度相似的结构和细胞形态学。在两种类型的PDO中均观察到亲代肿瘤的特征性组织学特征，包括相对丰度的嗜酸性至两性细胞质，不同程度的细胞质空泡化，局灶性形成“透明细胞”等多种表型。

04  EKGel和BME中乳腺癌类器官的基因表达

       为了评估在不同基质中生长的PDO之间基因表达的相似性，我们对每种条件下的细胞进行了RNA测序。源自在不同基质中生长的同一肿瘤的PDO聚集在一起，具有高相似性，PDO与其起源肿瘤之间的高度相似性。在差异表达分析中发现，只有六个基因在两个生长基质之间存在显着差异，但这些基因和乳腺癌的生物过程、药物反应等都没有显著相关性。总之，在EKGel和BME中生长的PDO之间基因表达的一致性，并且确定相关基因或途径的表达没有重大变化，这些变化预计会影响在EKGel中生长的模型用于基础研究或药理学测试。

05  乳腺肿瘤类器官对药物的反应

接下来，研究团队进行了体外药物测定，以探索在EKGel和BME中生长的类器官系对常用乳腺癌药物的化学敏感性。采用了以曲线上方面积(AAC)测量的药物敏感性的一种方法，紫杉醇、艾日布林、卡铂和阿霉素对于PDO-1、PDXO-2和PDO-3的作用没有观察到AAC值的显着差异。

06  类器官的启动

       在验证类器官可以在EKGel中成功启动和生长，同时保持其起源肿瘤的表型后，探索了EKGel在启动新的乳腺癌PDO和PDXO方面的潜力。处理了来自PDX或直接来自患者的多个肿瘤，将分离的单个肿瘤细胞平行铺板在EKGel和BME中，并监测类器官的起始。两种基质中类器官的总体启动率相似，即PDXO为88%，PDO为80%；各有一条线单独启动，表明启动特性不相同。通过类器官成像和/或流式细胞术确定，在BME中启动的17个PDX肿瘤类器官中，8个具有显着的小鼠细胞污染，小鼠细胞污染表现为较大的暗簇。将分离的、耗竭小鼠细胞的PDX肿瘤细胞平行铺板在EKGel（图6b）和BME（图6c）中并生长14天。然后对细胞进行流式细胞术以确定小鼠和人类细胞的含量，在BME中启动的样品是51.4%H2K+小鼠细胞，而在EKGel中接种的样品仅含有0.08%H2K+小鼠细胞，推测推测BME中正常小鼠细胞的增殖增加与BME基质中残留的TGF-β、IGF、PGFD等鼠生长因子的存在有关。

  (总结)

       作者团队开发了一种新的仿生水凝胶，用于有效启动和扩展乳腺癌PDO，并将其特性与BME（一种用于3D细胞培养的“金标准”水凝胶）进行基准测试。研究表明，EKGel具有高度可重复的机械性能、模仿肿瘤细胞外基质结构的纤维结构，且制备简单。EKGel能够支持具有不同组织学亚型和来自不同来源材料的乳腺癌PDO的启动和通过，乳房PDO的生长、致瘤性和药物反应在EKGel和BME之间是一致的；EKGel通过抑制BME中常见的鼠细胞污染和过度生长，在启动PDXO方面表现出明显的优势。

（点评）

       乳腺癌作为一种在全球范围内高发的恶性癌症，因为研究对象的局限限制了其基础研究。在EKGel中培养的乳腺癌类器官用作转化研究的体外模型，并具有在个性化癌症治疗中应用的潜力。除了乳腺癌组织以外，从广泛的组织类型中建立了包括健康组织、原发性肿瘤和转移性病变在内的多种类器官，EKGel有可能充当这些类器官类型的支架，使体外模型能够捕获可用于开发个性化癌症疗法的患者内和患者间异质性，用于对应的临床前研究。

（DOI）：10.1038/s41467-022-28788-6