Diabetes Care|成人潜伏性自身免疫性糖尿病患者的肠道微生物群和代谢特征

Diabetes Care|成人潜伏性自身免疫性糖尿病患者的肠道微生物群和代谢特征

发表期刊：DIABETES CARE

发表时间：2021.10.7

影响因子：19.112/Q1

原文链接：https://doi.org/10.2337/dc20-2975

简介

       本文是由河南省人民医院袁慧娟教授团队发表的题为“Characteristics of the Gut Microbiota and Metabolism in Patients With Latent Autoimmune Diabetes in Adults: A Case-Control Study”的文章，该研究运用多组学方法比较了LADA患者、经典T1D和T2D患者以及健康受试者的肠道微生物群和代谢谱，从而阐明了肠杆菌共生群(CAG)、代谢模块和临床表型之间的关系。

研究背景

       成人潜伏性自身免疫性糖尿病(LADA)是与1型糖尿病(T1D)和2型糖尿病(T2D)具有某些相似遗传、免疫、代谢和临床特征的成人发病自身免疫性糖尿病。

       LADA患者自身免疫b细胞的破坏程度低于经典的T1D患者，并且患者在确诊后至少6个月内不依赖胰岛素。在对T1D有中度遗传易感性的情况下，一些环境因素可以引发胰岛自身免疫，导致B细胞凋亡，并可能促进LADA，而目前LADA的发病机制尚不清楚。

       肠道微生物群是T1D和T2D发展不可或缺的环境因素。T1D和T2D患者肠道菌群的结构和组成与健康受试者不同。T1D动物模型研究表明，肠道菌群可以调节toll样受体 2/4 信号传导、肠粘膜中的 17 型 T 辅助细胞、性激素水平和胰腺抗菌肽的分泌，这可能会调节b 细胞的自身免疫靶向性。

       此外，在T2D中，肠道菌群失调会破坏肠道屏障功能，促进慢性代谢性炎症和肠道激素的分泌，包括胰高血糖素样肽1和肽YY，影响胰岛素敏感性和分泌。重要的是，研究表明饮食干预（益生菌、膳食纤维补充剂等）和粪便移植可以调节肠道微生物群；疫苗和各种调节影响肠道屏障功能的关键因素的药物可以作为新的治疗策略。然而，尚未在 LADA 患者中进行此类研究，因此肠道微生物群、代谢特征和 LADA 之间的关系仍有待确定。

实验材料与方法

研究人群：30例LADA、31例T1D、30例T2D和29例健康者。

研究方法：16S测序鉴定肠道菌群，液质非靶向测定粪便和血清代谢物。

临床数据采集：年龄、性别、糖尿病持续时间、体重、体质指数（BMI）、腰臀比、收缩压和舒张压。

生化数据采集：75克口服葡萄糖糖耐量实验（OGTT）、C-肽释放试验、糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FPG）、血脂谱、血细胞和血红蛋白计数、肝肾功能、自身抗体（谷氨酸脱羧酶自身抗体GADA、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体IA-2A、锌转运体 8 抗体ZnT8A）和炎症因子，以及OGTT期间葡萄糖（AUCGlucose）和C-肽（AUCC-peptide）的受试者工作特征曲线下面积（ROC）。

粪便DNA提取和16S测序分析：QIAamp PowerFecal Pro DNA试剂盒（QIAGEN, Hilden, Germany）提取基因组DNA；根据16S rRNA基因V3-V4区引物进行PCR，正向，5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'，反向，5'-GACTACHVGGGTA TCTAATCC-3'；MiSeq平台（Illumina, San Diego, CA）进行测序，300-bp的成对末端读数；

代谢组学分析：粪便和血清样品的代谢分析是使用1290 Infinity LC系统（Agilent, Santa Clara, CA）与TripleTOF 6600系统（SCIEX, Framingham, MA）耦合进行的。

16S数据分析：

       使用qiime2（2019.7）对测序数据进行拆分，并将正向和反向reads分别修剪为 268 bp 和 194 bp，得到平均48972个reads；在经过过滤、去噪、合并正反向reads，去嵌合体后，得到平均26908个reads。

       使用DADA2插件识别扩增子序列变异体（ASV），在使用 QIIME2多样性插件core-metrics-phylogenetic进行粪便微生物组分析之前，将样本随机二次采样到 20,148 个reads的相等深度。生成的原始测序数据可在国家生物技术信息中心以登录号公开获得SRP272175(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA646610)。

       使用core-metrics-phylogenetic pipeline插件构建代表性ASV序列的系统发育树，并根据SILVA第132版数据库对ASV进行了注释。

       使用R包vegan进行adonis测试，计算每个宿主因子的变化。使用QIIME2对样品的多样性、丰富性和均匀性进行了评估。每个宿主生理因子根据其解释率进行计算；P值是根据9,999次的排列组合产生的。

       计算所有样品的Bray-Curtis距离。根据ASV丰度表进行主坐标分析（PCoA），使用R包mixOmics进行基于Bray-Curtis距离的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。

       通过线性判别分析效应大小确定各组之间的差异性ASVs。主要的ASVs被定义为LADA组与健康组、T1D-A（GADA阳性[GADA-P]）、T1D-B（GADA阴性[GADA-N]）和T2D组之间的差异。根据主要ASVs的Spearman相关性，使用WGCNA（加权基因共表达网络分析）和R中的Ward聚类算法对CAGs进行聚类。

       使用GraphPad Prism 8.0.1中的Kruskal-Wallis检验和Dunn事后分析，将健康组、T1D-A组、T1D-B组和T2D组的ASVs和CAGs丰度与LADA组进行比较；LADA、T1D-A、T1D-B和T2D组也与健康组进行比较，P<0.05时认为差异显著。

       使用PICRUSt2从ASVs预测肠道微生物群的功能，KEGG注释。

       使用R包MASS对LADA和健康组、T1D-A组、T1D-B组和T2D组之间以及健康组和T1D-A组、T1D-B组和T2D组之间进行Wilcoxon秩和检验（每个途径）。

代谢组学数据分析：

       根据10倍交叉验证的OPLS-DA模型产生的投影中的变量重要性VIP>=1的阈值来确定差异性代谢物，然后在单变量水平上用调整后的P<0.05进行验证。

       使用R包WGCNA对LADA与健康组、T1D-A组、T1D-B组和T2D组之间存在差异的代谢物进行聚类。对血清和粪便代谢物分别进行分析。对研究中的所有个体计算了代谢物的符号加权共丰度相关网络。代谢物相关的软阈值β=14，是根据无标度拓扑标准来选择的。用动态混合树形切割算法识别聚类，DeepSplit为4，最小聚类大小为3。枢纽代谢物被定义为每个模块内具有最高模块成员P值的代谢物。代谢物模块的热图是用MATLAB R2019b绘制的。

       在健康组、GADA-P（LADA 和 T1DA）和 GADA-N（T1D-B）个体和 T2D 患者中对以正离子和负离子模式检测到的粪便和血清代谢物基于 BrayCurtis距离上进行PCoA。在GraphPad Prism 8.0.1 中使用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn post hoc 分析将健康组、T1D-A、T1D-B 和 T2D 组中代谢物模块的丰度与 LADA 组中的丰度进行比较； LADA、T1D-A、T1D-B、T2D组与健康组比较。当 P < 0.05 时，差异被认为是显着的。

多组学相关分析：

       使用MATLAB R2019b计算了肠道微生物群CAGs、粪便代谢物模块、血清代谢物模块和临床参数之间的Spearman关联性。显著性被设定为FDR<0.05，使用Cytoscape 3.7.2进行可视化。  

结果

表1. 人体测量和生化测量数据

       表1列出了患者的人体测量和生化数据。LADA组的糖尿病持续时间比其他两个糖尿病组短。LADA组、T1D组的平均BMI低于T2D组和健康组。正如预期的那样，LADA组、经典型T1D组和T2D组的空腹血糖（FPG）和糖化血红蛋白（HbA1c）水平均显著高于健康组，而LADA组和T1D组的空腹C肽水平低于T2D组和健康组。血压读数在四组之间没有差异。T2D组的高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平明显低于其他组。LADA组IL-10水平明显低于其他组。三组糖尿病患者TNF-α水平明显高于健康组。LADA组和T1D组IL-6和IL-1b水平明显低于对照组，T2 D组和T1D组显著高于健康组。糖尿病三组LBP水平均高于健康组，LADA组LBP水平最高。

LADA患者肠道微生物群特征的研究

补充图1. 健康受试者、LADA、(T1D-A；GADA阳性)、 (T1D-B；GADA阴性)和T2D组之间α多样性(A，多样性；B，丰富度和C，均匀度)的比较。

补充图2. LADA患者与健康受试者以及T1D和T2D患者之间肠道微生物区系的比较

图1. LADA环境中主要ASV模块的识别

       在四组之间没有发现丰富度（Observed ASVs）、多样性（Shannon指数）和均匀度（Pielou指数）的差异（补充图1）。然而，PLS-DA的PCoA和Score曲线图(图1A和补充图2)显示，肠道微生物群的结构和组成在三个糖尿病组和健康组之间存在显著差异。此外，LADA组和其他两个糖尿病组之间的微生物群结构也有显著差异。临床组、炎症因子、自身抗体GADA和药物使用都与肠道微生物的变化有明显的关系(P<0.1的置换Manova)(图1B)。由于GADA是肠道微生物群变异的一个非常有力的解释因素， T1D组又被进一步分为T1D-A组(GADA-P)和T1D-B组(GADA-N)。T1D-A组的微生物群结构与LADA组最相似，而T2D组的微生物群结构与LADA组最不相似(图1C和D)。LADA、T1D-A和T1D-B组的临床特征如补充表2所示。T1D-B组的BMI、AUCC-肽和血清LBP水平低于LADA和T1D-A组，糖尿病持续时间比LADA和T1D-A组长。

       此外，该研究确定了139个ASVs来探索LADA特异性微生物群，并根据Spearman相关分析（图1E）来构建12个CAGs。LADA患者的CAG2（瘤胃球菌科和毛螺旋菌科）、CAG4（如副拟杆菌属[spp.]）、CAG5（主要在梭菌科）和CAG6（包括普雷沃特菌属）的丰度明显低于健康组。LADA组与T1D-A组、T1D-B组和T2D组相比，CAG4和CAG9、CAG6和CAG12（即瘤胃球菌科Ruminococcaceae和毛螺旋菌科Lachnospiraceae）以及单独的CAG4的丰度也分别明显降低（图1F）。总之，这些发现表明，LADA患者具有独特的肠道微生物群，在结构和组成上与健康组和经典的T1D和T2D患者不同。

补充图5.LADA、健康受试者、(T1D-A，GADA阳性)、 (T1D-B，GADA阴性)和2型糖尿病(T2D)组之间肠道微生物区系不同预测KEGG代谢途径的热图

       为了进一步了解情况，该研究还根据获得的16S rRNA基因测序数据，利用PICRUSt2预测了可能富集的途径（补充图5）。LADA组的氨基酸、碳水化合物和脂类代谢途径(包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解)和脂肪酸生物合成途径显著下调。而二级胆汁酸生物合成途径在LADA中被上调（与健康组相比）。LADA与T2D相比，氨基酸、辅助因子和维生素的代谢途径(如苯丙氨酸代谢)也显著减少。而LADA与T1D组相比无明显差异。

补充图6.健康受试者、GADA阳性(GADA-P)、GADA阴性(GADA-N)和2型糖尿病(T2D)组之间的α多样性(A，多样性；B，丰富度和C，均匀度)的比较。

补充图7.健康受试者、GADA阳性(GADA-P)、GADA阴性(GADA-N)和2型糖尿病(T2D)组之间肠道微生物区系的比较。

补充图8.GADA阳性(GADA-P)、GADA阴性(GADA-N)和2型糖尿病(T2D)组之间肠道微生物区系的比较。

       考虑到所有由自身免疫性b细胞破坏引起的糖尿病都包括在T1D范围内，LADA和经典T1D患者被集体分为GADA-P组和GADA-N组。GADA-P组、GADA-N组、T2D组和健康组之间的α-多样性没有差异(补充图6)。然而，肠道微生物群的结构和组成在GADA-P组和健康组之间有显著差异(补充图7和8)。

LADA患者粪便和血清代谢物的特征

图2. 在LADA 的背景下识别主要的粪便和血清代谢物模块

       糖尿病患者与健康受试者的粪便和血清代谢物存在显着差异。值得注意的是，LADA患者的代谢物特征与健康受试者和 T1D 和 T2D 患者显着不同（图 2）。该研究在粪便中，分别在正离子模式和负离子模式下鉴定出 422 和 317 种代谢物，它们被分成 12 个共丰度簇。

此外，在血清中，分别在正离子模式和负离子模式下鉴定出 178 和 147 种代谢物，它们被分成11个共丰度簇。与健康受试者相比，研究发现大多数粪便代谢物模块（即二肽、中链脂肪酸、己糖）含量较低，而大多数血清代谢物模块（如环己醇、谷氨酸及其衍生物、α-氨基酸、脯氨酸）及其衍生物）在糖尿病患者中更为丰富。

       值得注意的是，就粪便代谢物而言，LADA与T1D-A组相比胸腺嘧啶丰度较低，而LADA 与T2D组中二肽（包括酪氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸）丰度较高。此外，关于血清代谢物，LADA组的脯氨酸及其衍生物比T1D–A组更丰富，而谷氨酸及其衍生物和α-氨基酸在LADA组中的含量低于T1D-B 组。虽然PCoA表明，对于粪便代谢物，仅在三个普通糖尿病组（GADA-P、GADA-N、T2D）和健康受试者之间观察到差异，但对于血清代谢物，在三个糖尿病组和健康受试者之间以及GADA-P和GADA-N组之间均存在差异（补充图 11-15）。因此，总的来说，这些结果表明糖尿病患者与健康受试者相比具有显着不同的代谢物谱，并且LADA患者与T1D-A、T1D-B和 T2D患者的代谢物水平不同。

肠道微生物群、粪便代谢物、血清代谢物和临床表型之间的关系

图3. LADA情况下肠道微生物群、宿主粪便或血清代谢物和宿主临床表型之间的相关性

       随后，该研究分析了所有参与者的肠道微生物群概况、粪便代谢物、血清代谢物和临床表型之间的相关性（图3）。六个粪便代谢物模块，主要是含二肽的支链氨基酸（BCAA）（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）和芳香族氨基酸（AAA）（酪氨酸和苯丙氨酸），与糖代谢相关参数呈负相关，但与胰岛功能相关参数呈正相关。相反，六个血清代谢物模块与糖代谢相关参数呈正相关，与胰岛功能相关参数呈负相关。CAG2、CAG4和CAG6在LADA组中含量较少，通过粪便代谢物与糖代谢和胰岛功能相关参数相关。CAG5与IL-6和IL-1b呈负相关，而CAG2和CAG4则通过粪便和血清代谢物与TNF-a相关。L-脯氨酸和次黄嘌呤与枸杞碱呈正相关关系。值得注意的是，CAG2、CAG4、CAG6 以及粪便代谢物 BCAAs 和 AAAs 均与 GADA 呈负相关；此外，粪便代谢物 BCAAs 和 AAAs 也与 ZnT8A 和 IA-2A 呈负相关。

结论

       LADA患者肠道菌群及其代谢产物的结构和组成明显不同，如短链脂肪酸产生菌Faecalibacterium spp., Roseburia spp.和Blautia spp.丰度显著降低，LADA患者的肠道菌群结构与GAD抗体阳性的T1D更为相似，鉴定了7个血清代谢物模块和8个粪便代谢物模块，这些模块在LADA组和其他组之间存在差异。

       该研究确定了粪便和血液中的特定物质，如由肠道细菌产生的BCAA和AAA，这些物质在LADA患者与其他糖尿病患者中是不同的。值得注意的是，它们与葡萄糖代谢相关，可能影响葡萄糖代谢和敏感性，并促进LADA患者的自身抗体表达。

       6个粪便代谢模块含二肽支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)和芳香氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)与葡萄糖代谢相关参数呈负相关，与胰岛功能相关参数呈正相关；6个血清代谢物模块与糖代谢相关参数呈正相关，与胰岛功能相关参数呈负相关。

       LADA患者特有的肠道菌群及相关代谢产物与自身抗体、糖代谢、胰岛功能、炎症因子有关，可能与LADA发病有关，未来的纵向研究应探索是否调节肠道菌群和相关代谢物可以改变自身免疫性糖尿病的自然进程，以寻求新的治疗方法。

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