深度蛋白质组学分析揭示了芳基硫酸酯酶A作为非酒精性脂肪性肝炎诱导的肝因子和血糖控制的调节剂
发布日期：2022-03-31 浏览次数：2310
深度蛋白质组学分析揭示了芳基硫酸酯酶A作为非酒精性脂肪性肝炎诱导的肝因子和血糖控制的调节剂
副标题：揭示了肝脏与肌肉通讯调节剂和2型糖尿病的潜在治疗靶点
简介：
2022年3月10日，Nature Communication(IF=14.919)发表了一篇题为“Deep proteomic profiling unveils arylsulfatase A as a non-alcoholic steatohepatitis inducible hepatokine and regulator of glycemic control”的研究论文。该文章揭示了与胰岛素抵抗和适应不良脂质代谢相关的肝因子重塑，并将芳基硫酸酯酶A（ARSA）鉴定为在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和2型糖尿病中上调的肝因子。这项研究提供了一个独特的资源，描述了NASH中肝因子分泌的全局变化，并将ARSA确定为肝脏与肌肉通讯的调节剂，并且是2型糖尿病的潜在治疗靶点。
背景：
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肥胖与2型糖尿病（T2D）有强烈的关联，在NASH患者中，估计肥胖症的患病率为57-64%，T2D的患病率为37%，这一发病率大大超过了在一般人群中观察到的3-5%。肝脏是代谢的重要调节剂，在胆固醇、甘油三酯和葡萄糖代谢中起着关键作用。脂肪性肝细胞的分泌因子诱导受体细胞中的促炎信号传导和胰岛素抵抗。
芳基硫酸酯酶A（ARSA）是一种在NASH中受调控的肝细胞分泌蛋白，循环 ARSA 可通过普遍表达的甘露糖-6-磷酸受体进行内吞细胞，进入肝脏的摄取量最高，这表明循环ARSA在调节细胞功能方面具有合理的作用，特别是在肝脏中。
研究思路：
①利用两种饮食手段构建了NASH模型
②通过蛋白质组学鉴定差异分泌蛋白，鉴定出了上调的蛋白ARSA
③产生重组ARSA注射小鼠，证明了ARSA对血糖的控制作用
④分别过表达和敲低ARSA，发现肝脏ARSA通过改善骨骼肌胰岛素作用影响血糖控制
⑤确定了ARSA直接作用于肌肉改善骨骼肌胰岛素作用
⑥通过减少过表达ARSA小鼠的LPA可以改善肌肉胰岛素敏感性
结果
3.1 NASH改变肝细胞蛋白质组和肝因子分泌
作者通过分别喂养小鼠12周的蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食或富含2%胆固醇（CHOL）的高脂肪，高果糖饮食10个月诱导出两种NASH模型，对从这两种NASH小鼠肝脏中分离的肝细胞内和分泌的蛋白质进行了LC-MS/MS分析（图1a）。
分析显示肝细胞分泌蛋白的组成受到NASH的显着影响，MCD和CHOL饮食之间NASH诱导的蛋白质分泌变化呈正相关（图1g）。
3.2 NASH分泌因子诱导胰岛素抵抗和脂质代谢缺陷
从喂养对照和NASH诱导饮食的小鼠中分离出肝细胞，收集含有肝细胞分泌因子的培养基（图1a）并应用于3T3-L1小鼠脂肪细胞，完全分化的C2C12小鼠肌管和原代小鼠肝细胞。这些NASH分泌因子减少了所有细胞类型中蛋白激酶Akt，胰岛素受体（IR）和/或胰岛素受体底物1（IRS1）的胰岛素刺激磷酸化（图1i，j）。NASH肝细胞培养基诱导胰岛素刺激的2-脱氧葡萄糖摄取降低约40%（图1k）。这些结果表明，从NASH小鼠肝脏衍生的肝细胞分泌的因子诱导胰岛素抵抗。
此外，诱导饮食组 NASH分泌因子增加了脂肪分解（图1l）。
3.3 鉴定 NASH 调控的蛋白质
在NASH影响的约275种经典分泌蛋白中（图1f），25种蛋白质显著减少>两倍，两种NASH模型中8种蛋白质显著增加>两倍（图1o）。
在显着减少的蛋白质中，9种蛋白质在肝脏解毒中起着至关重要的作用;4种参与酰基甘油的降解;其中2种是蛋白质二硫化物异构酶，催化蛋白质中二硫键的重排。
在两种NASH饮食中分泌增加的八种蛋白质中，作者对芳基硫酸酯酶a（ARSA）特别感兴趣，ARSA是一种溶酶体蛋白质，可将鞘氨醇磺酸盐降解为半乳糖基神经酰胺，其可进一步降解为神经酰胺。神经酰胺可以抑制胰岛素作用。
图1：NASH分泌蛋白的鉴定和表征
3.4 ARSA在小鼠和人NASH中升高
作者研究了在人类中NASH诱导的ARSA增加是否也很明显。通过对腹腔镜减肥手术的个体进行肝活检。病理学评估结果表明，ARSA mRNA表达倾向于随着非酒精性脂肪肝（NAFL）的增加而增加，并且与NASH强烈上调（图2a）。从患者获得的NAFL和NASH精确切割肝脏切片的ARSA蛋白分泌增加（图2b），ARSA分泌随着脂肪变性而增加（图2c）。与无糖尿病相比，T2D 患者的肝脏 ARSA 分泌增加（图 2d）。与胰岛素敏感小鼠相比，胰岛素抵抗小鼠的血浆中的ARSA高出三倍（图2e）
总之， ARSA分泌在NASH中增加，与脂肪变性最密切相关，并且与胰岛素抵抗有关。
图2： NASH和2型糖尿病患者中ARSA的表达和分泌。
3.5 急性 ARSA 给药改善血糖控制
为了研究ARSA对血糖控制的作用，作者首先产生了重组鼠蛋白，将重组ARSA注射到瘦小鼠中，1小时后，在口服葡萄糖给药后评估血糖。ARSA给药使血浆ARSA水平提高了三倍（图3a）并改善了血糖控制（图3b），而不会影响基础或葡萄糖刺激的血浆胰岛素水平（图3c）。急性ARSA注射不影响瘦小鼠的胰岛素敏感性（图3d）。ARSA对血糖控制的影响在肥胖的胰岛素抵抗小鼠中得到了概括（图3e，f），证明了ARSA可能具有内分泌作用。
图3：急性重组ARSA给药改善血糖控制
3.6 增加肝ARSA改善2型糖尿病小鼠的血糖控制和肌肉胰岛素作用
在肥胖的小鼠的肝脏中使用腺相关病毒（ARSA-AAV）过度表达，发现肝脏切片的ARSA分泌增加了三倍（图4c），血浆ARSA水平随ARSA-AAV适度增加（图4d），可能反映了分泌蛋白的快速清除。
肝ARSA过表达降低了小鼠的空腹血糖水平（图4e），改善了小鼠的全身胰岛素作用（图4g）。进一步研究表明，ARSA-AAV增加了胰岛素介导的葡萄糖处理到体内骨骼肌（图4h）。
作者收集了ARSA-AAV和对照-AAV小鼠的肝脏分泌因子，并将其应用于分化的C2C12肌管。与对照-AAV相比，当暴露于ARSA-AAV肝脏分泌因子时，胰岛素刺激的葡萄糖摄取到肌管中增加（图4j）。
3.7 肝脏中的ARSA敲低损害小鼠的血糖控制和胰岛素作用
作者研究了肝脏ARSA基因沉默调节瘦小鼠血糖控制的依赖性。值得注意的是，ARSA基因表达的轻度降低可能与整个肝脏有关，其中非ARSA沉默的目标占肝细胞总数的40%，稀释了肝细胞中明显的治疗效果。虽然血浆ARSA没有显着降低（图4l），但肝脏敲低显着增加了空腹血糖（图4m）并恶化了葡萄糖耐量（图4n），全身胰岛素敏感性（图4o）和胰岛素刺激的葡萄糖摄取进入骨骼肌（图4p）。
总体而言，肝脏ARSA通过改善骨骼肌胰岛素作用来影响全身血糖控制。
图4：肝脏特异性ARSA过表达和敲低对血糖控制的影响
3.8 肝脏ARSA不直接调节骨骼肌脂筏组成或胰岛素作用
接下来的目标是确定肝脏来源的ARSA如何改善骨骼肌胰岛素作用。ARSA的主要已知功能是主要局限于细胞表面脂筏的硫化物脂质的分解（图5a）。MS/MS分析显示治疗组之间的脂筏蛋白质组没有显着差异（图5d）。在分化的C2C12肌管中的进一步实验表明，重组小鼠ARSA不直接影响胰岛素刺激的葡萄糖摄取（图5e）。
这些数据表明，ARSA在肌肉中的胰岛素致敏作用不是由脂筏组成的变化介导的，ARSA对肌肉是直接作用而不是介导的。
图5：肝脏来源的ARSA不调节骨骼肌脂筏
3.9 肝ARSA减少肝脏的LPC和LPA分泌，调节血浆LPA和骨骼肌胰岛素作用
使用精密切割的肝脏切片的研究表明，与对照-AAV相比，ARSA-AAV的LPC分泌减少了70%（图6a），LPA分泌减少了97%（图6b）。ARSA过表达降低了小鼠的血浆LPC和LPA水平（图6c，d）。
血浆LPA在ARSA介导的肝肌通讯中的重要性得到了进一步支持，即肝ARSA敲低降低了小鼠的胰岛素敏感性和肌肉胰岛素作用，伴随血浆LPA增加（图6f）。
接下来测试了减少ARSA-shRNA小鼠中的血浆LPA是否会提高胰岛素敏感性，这将使血浆LPA水平降低95%（图6g)
总之，较低的循环LPA水平通过肝ARSA过表达可以改善肌肉胰岛素敏感性。
图6：ARSA的硫化物降解能力是其对肝脏LPC和LPA分泌以及血糖控制的影响所必需的
总结：
NASH与流行的代谢性疾病密切相关，包括肥胖和2型糖尿病，然而，肝脏来源的循环因子在多大程度上导致NASH的代谢合并症尚未解决。作者开发了一种独特的资源，描述了小鼠NASH中肝因子分泌的全局变化，它提供了对NASH中潜在内分泌回路的更深入的了解，并确定了相关合并症的假定治疗靶点，特别是血糖控制受损。使用该系统，ARSA被鉴定为一种肝脏分泌蛋白，在NASH和人类2型糖尿病中增加。ARSA调节了肝脏硫化物和溶血磷脂代谢，减少了脂筏的LPC和LPA分泌，从而改善了骨骼肌胰岛素敏感性和全身血糖控制。
点评：
目前某些疾病的发生机制或者疾病与疾病之间的关联是研究热点，发现疾病机制是找到治疗疾病的靶点或者研发药物的基础，具有很重要的实际意义。这篇研究以蛋白质组学等方法为技术手段，筛选出了ARSA，对于NASH和T2D具有强大的调节作用，对后续对NASH和T2D的治疗有重要的临床意义。探究过程清晰明了，循序渐进，为后续使用蛋白质组学方法找到某几种疾病之间的关联，乃至于找到关键作用位点提供了参考。
· DOI: 10.1038/s41467-022-28889-2
