Nature Communications|PUMILIO蛋白通过抑制p21促进结直肠癌的生长

Nature Communications|PUMILIO蛋白通过抑制p21促进结直肠癌的生长

简介

2022年03月25日，生物类期刊Nature Communications（IF=14.919）在线发表了题为“PUMILIO proteins promote colorectal cancer growth via suppressing p21（PUMILIO蛋白通过抑制p21促进结直肠癌的生长）”。研究发现了PUF家族的转录后调节因子PUMILIO(PUM)中的PUM1和PUM2在人类结直肠癌(CRC)中的表达增加，揭示了PUM蛋白对CRC进展的需求及其作为治疗靶点的潜力。

研究背景

根据全球流行病学分析结果显示，结直肠癌（CRC）的发生率占所有癌症的10%，死亡率排名第二。PI3K等关键信号通路在驱动CRC中的作用已被广泛研究，但它的发病率和死亡率仍处于各类癌症的前列，因此迫切需要研究CRC发病机制的新分子机制，以进行早期检测、诊断和靶向治疗。PUMILIO(PUM)蛋白属于高度保守的PUF(Pumilio-Fem3结合因子)家族的RNA结合蛋白，有PUM1和PUM2两种亚型。PUM蛋白与靶mRNA的3'UTR结合并募集伴侣蛋白以降低mRNA的稳定性或抑制其翻译，许多靶基因在胚胎发育、体轴形成、体型控制、神经发生、精子发生和干细胞的自我更新有所作用，PUM蛋白在结直肠肿瘤发生中的功能和作用机制是很有吸引力的研究方向。

研究思路

l 探究PUM蛋白在癌症中的功能

l 特异性敲除小鼠评估PUM在CRC进程中作用

l 细胞实验验证表达

l 分子机制探究

l 治疗效果验证

研究结果

01 PUM1和PUM2在人类CRC中的表达增加

利用包含患者临床特征和基因表达数据的在线数据库进行分析，研究PUM蛋白在癌症中的功能。首先在人类蛋白质图谱中检测了PUM蛋白在不同肿瘤中的表达，发现PUM1在CRC中的蛋白水平最高；其次对癌症基因组图谱(TCGA)数据集进行分析，发现Pum1的转录本在结肠直肠样本中表达水平较高。对临床样本进行比较，Pum1和Pum2在CRC临床标本中高度表达，Pum1表达与CRC阶段呈正相关。

02 Pum1和Pum2的肠道特异性缺失抑制AOM/DSS诱导的体内结肠癌发生

为了检查PUM蛋白在CRC中的作用，采用AOM/DSS小鼠模型（AOM是一种致癌物质可诱导DNA中的G向A转变，DSS是一种导致上皮损伤和结肠炎症的试剂），通过条件性敲除肠上皮细胞中的Pum1和Pum2基因来评估PUM蛋白的作用。在AOM/DSS处理后，与对照小鼠相比，Pum1/2CKO小鼠肠道中肿瘤的数量和大小显着减少，同时表现出高度不典型增生的腺瘤显着减少，表明Pum1/2缺乏显着抑制了CRC的发生和发展。

03 PUM蛋白有助于体外CRC细胞生长及其体内致瘤性

以正常人结肠粘膜上皮细胞系NCM460作为对照，验证了Pum1和Pum2在六种不同的CRC细胞系中的表达，Pum1在所有六种CRC细胞系中的表达水平显着高于正常细胞系，Pum2在六种癌细胞系中的五种中显示出异常高水平的表达。选择HCT116作为细胞模型，Pum1和Pum2的单独或同时敲低在体外抑制了CRC细胞的生长，Pum1和Pum2的双重敲低显示出附加缺陷。使用CRISPR/Cas9切口酶在HCT116和RKO细胞中敲除Pum1或Pum2，Pum1和Pum2的缺失显着抑制了HCT116和RKO细胞的集落形成和增殖。

04 PUM1在CRC细胞中主要通过直接调节癌症相关和细胞周期相关基因发挥作用

为了探究CRC中PUM的功能分子机制，对Pum1和Pum2敲除细胞进行深度测序。首先是转录组分析，鉴定了1132和1226个差异表达基因。在Pum1-/-细胞中，740个基因的mRNA水平升高，其中包括Cdkn1a/p21、Cdkn2d和Cdkn2c在内的几个细胞周期抑制基因被上调。而后进行了蛋白质谱的分析，细胞周期抑制基因Cdkn1a/p21的mRNA和蛋白质水平在Pum1-/-HCT116细胞中上调，PUM1可能会抑制CRC中的p21翻译。Wnt信号通路抑制剂Dkk1和肿瘤抑制基因Susd2和Pdlim5的蛋白质水平也在Pum2-/-HCT116细胞中上调，表明Wnt通路的参与。

为了识别PUM1的直接靶标，在WTHCT116细胞中进行了PUM1PAR-CLIP实验。PUM1结合转录本的大重叠，重点关注负责G1进展的基因，发现细胞周期和癌症通路在PUM1直接靶标中富集。进一步分析在Pum1-/-HCT116细胞中表达发生变化的1968种蛋白质，15种改变的mRNA和48种改变的蛋白质被鉴定为PUM1的靶标。PUM1是CRC细胞生长所必需的，主要通过直接调节癌症相关和细胞周期相关基因。

05 PUM1直接抑制p21以调节CRC生长

在PAR-CLIP-seq实验揭示的PUM1直接靶标中，p21在G1/S相变中起重要作用。RNA深度测序和蛋白质质谱显示p21在RNA和蛋白质水平上都被PUM1抑制，Pum1-/-细胞中p21的RNA和蛋白质水平都增加了。PUM1通过负调节其mRNA稳定性来抑制p21，但PUM2对p21 mRNA稳定性几乎没有影响；双荧光素酶报告基因检测表明PUM1通过3'UTR中的PRE抑制p21表达。

通过敲入HCT116细胞基因组中突变的PRE供体序列来突变p21基因中的PRE，这种改变降低了PUM1与p21 mRNA的结合，并导致p21mRNA和蛋白质的表达增加，p21PRE mut/mut减轻了p21 mRNA被PUM1的抑制。对p21PRE mut/mut细胞生长情况进行分析，发现细胞集落形成减少、细胞增殖减少和G0/G1期细胞比例增加，表明p21mRNA是PUM1促进CRC细胞生长的直接和主要靶标。

06纳米颗粒包裹的PUMsiRNA部分抑制CRC的发展

为了探索使用PUM1和PUM2作为抗癌治疗靶点的可能性，利用HCT116-luc和COLO205-luc两种原位结肠癌模型进一步研究了负载siRNA的纳米颗粒的体内抗肿瘤活性。将肿瘤细胞皮下植入4周大的雄性BALB/c裸鼠体内，植入28天后小鼠表现出相当的肿瘤生物发光强度。注射负载有抗Pum1siRNA或抗Pum2siRNA显着抑制肿瘤生长，表现出最强的抗肿瘤作用。试验结束后处死小鼠，发现siPum1/2@MSN治疗的小鼠的肿瘤比用对照治疗的小鼠小3.7-4.0倍；在COLO205荷瘤小鼠模型中也观察到类似的抗肿瘤作用。通过纳米颗粒递送Pum1或/和Pum2siRNA可阻止体内CRC的进一步生长，并且Pum1/2是治疗CRC的潜在靶标。

总结

研究者团队通过一系列探究发现条件性敲除Pum1和Pum2有效地阻止了结直肠肿瘤的发生和发展，PUM蛋白与CRC的发生进展强关联。PUM1在CRC中高度表达并与p21mRNA结合以降低其表达，减轻了p21对细胞周期和细胞生长机制的抑制从而使CRC进展。通过尾静脉注射包裹有抗Pum1/2siRNA的纳米粒子来治疗结肠原位植入肿瘤时，阻止了结直肠肿瘤的进一步生长而对其他器官没有明显影响。

点评

结直肠癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率逐年增加，但在其机制研究上仍有很多未明的部分。本文报道了人类PUF蛋白家族的两个成员PUM1和PUM2对CRC的起始和进展的需求，功能关联细胞周期调节因子P21。这项研究提供了对CRC肿瘤发生重要的新的分子机制以及治疗CRC的潜在新方法的见解。

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29309-1