Advanced Science|一种可注射的功能性水凝胶通过调节ROS/NO不平衡来防止心肌缺血/再灌注损伤

Advanced Science|一种可注射的功能性水凝胶通过调节ROS/NO不平衡来防止心肌缺血/再灌注损伤

简介

       2022年03月23日，综合类期刊Advanced Science（IF=15.8）在线发表了题为“An Injectable Dual-Function Hydrogel Protects Against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury by Modulating ROS/NO Disequilibrium（一种可注射的功能性水凝胶通过调节ROS/NO不平衡来防止心肌缺血/再灌注损伤）”的文章。研究团队利用一种可以响应ROS刺激释放NO的可注射的水凝胶，调节缺血/再灌注(I/R)损伤后的ROS/NO不平衡，为I/R损伤后的组织器官功能保护提供一种治疗思路。

研究背景

       心肌梗死（MI）是缺血性心脏病的常见表现，病理定义为长期缺血导致心肌细胞坏死。由于终末分化的心肌细胞无法再生，心肌梗死后的修复一般会形成纤维化的瘢痕组织，这种组织缺乏正常细胞的导电和搜索能力，最终演变为心力衰竭成为死亡的一个主要原因。一氧化氮(NO)是一种多功能信号分子，完整的NO信号传导因其调节血管张力、血小板聚集和心脏功能对于心血管系统的稳态至关重要。心肌缺血/再灌注(I/R)损伤导致进一步损害线粒体功能的氧化应激，NO信号传导受损导致心脏中ROS和RNS之间的不平衡，进而引发心血管系统衰竭。

研究思路

•        CS-B-NO的制备与表征
•        水凝胶调节ROS/NO不平衡功能验证
•        改善小鼠心肌I/R损伤和新功能
•        分子机制探究

研究结果

01 CS-B-NO水凝胶的制备和表征

       I/R心脏损伤通常以ROS的爆发为特征，从而进一步加剧缺血性损伤。受这种病理特征的影响，设计了一种微环境响应性（在ROS刺激下释放NO）的功能性水凝胶CS-B-NO。由于苯基硼酸酯和壳聚糖上的羟基/氨基之间的动态硼酸酯键合，CS-B-NO形成了坚固的水凝胶；链间键的剪切速率依赖性断裂的特征；体外降解实验表明， CS-B-NO水凝胶在PBS中相对稳定，添加H2O2后加速降解；体外NO释放实验，表征水凝胶与不同浓度的H2O2孵育后，NO可以受控和持续地从CS-B-NO中释放出来。

02 CS-B-NO水凝胶在体外调节ROS/NO不平衡

       为了确定CS-B-NO水凝胶对I/R损伤后ROS/NO不平衡的调节作用，利用H2O2处理的H9C2细胞建立了体外氧化应激模型。分别用H2O2测定试剂盒和化学发光NO分析仪监测细胞培养上清液中H2O2和NO的水平，发现氧化应激导致ROS和NO的不平衡，CS-B和CS-NO水凝胶分别通过直接清除H2O2或产生NO来纠正这种不平衡。正常条件下H9C2细胞中观察到微弱的红色和绿色荧光，氧化应激损伤后因产生超氧化物而产生红色荧光，在施用CS-B、CS-NO、CS-B-NO时荧光密度依次降低，相反指示NO的绿色荧光遵循相反的趋势，在用CS-B-NO处理时观察到的密度最高。

03 CS-B-NO水凝胶调节I/R损伤后心肌ROS/NO不平衡

       为了进一步研究了CS-B-NO对心肌I/R损伤小鼠模型中失调的ROS/NO平衡的调节作用，使用H2O2敏感的近红外荧光探针通过实时成像评估梗塞心脏中的H2O2生成。与假手术组相比，I/R损伤后荧光信号显着升高，功能性水凝胶治疗后显著降低，在CS-B-NO组中观察到最低的H2O2产量。I/R组CS-B-NO产生的NO大约是假手术组的3倍，表明NO释放行为受局部H2O2水平控制。使用CS-B-NO水凝胶可以通过同时释放NO和清除H2O2来有效调节I/R损伤后ROS和NO的局部浓度。

04 CS-B-NO水凝胶早期改善小鼠心肌I/R损伤

       TTC染色用于比较不同组再灌注开始后2天的心脏损伤程度，注射CS-B和CS-NO水凝胶适度减少了受损面积，并且在用CS-B处理的小鼠中梗死面积显着减少。I/R应激导致心肌细胞凋亡增加，水凝胶处理后TUNEL阳性心肌细胞的数量显着减少。I/R损伤导致血清cTnT（血清心肌肌钙蛋白T）和LDH（乳酸脱氢酶）两种心肌损伤标志物的水平显着升高，用CS-B和CS-NO水凝胶处理降低了血清cTnT和LDH的水平，CS-B-NO水凝胶对心脏损伤的中的保护作用。在CS-B-NO处理后，抗凋亡分子BCL-2的表达上调，而促凋亡分子Bax、Bad、Caspase3和cleavedCaspase3的表达在基因和蛋白质水平上均下调。

05 CS-B-NO水凝胶改善心脏功能

       通过超声心动图在指定时间点测量水凝胶治疗对I/R手术后心脏功能的影响,注射CS-B-NO水凝胶可改善左心室射血分数(LV-EF)和LV缩短分数(LV-FS)等心脏射血功能指标，心脏尺寸也保持良好。与心脏功能的改善一致，水凝胶也改善了心脏形态，Masson染色显示CS-B-NO组的梗死面积比I/R和CS组小约三倍；WGA染色显示治疗有效减少了I/R心脏中心肌细胞的横截面积。在正常心脏组织中，几乎没有观察硝化产物硝基酪氨酸到阳性染色，在I/R组和CS组的再灌注心肌内均观察到硝基酪氨酸的强阳性绿色染色，CS-B和CS-NO水凝胶处理大大抑制了硝基酪氨酸的表达。

06 CS-B-NO水凝胶通过抑制NF-κB信号通路调节心脏炎症反应

       巨噬细胞是炎症消退和修复过渡的主要参与者，使用功能性水凝胶治疗可有效增加M2巨噬细胞向心脏的浸润。CS-B-NO水凝胶表现出最有效的免疫调节作用，即M1巨噬细胞分泌的促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS）水平显着降低。心肌I/R导致爆发的氧化应激，产生过量的ROS加剧炎症。I/R损伤诱导NF-κB活化并增强IKK和IκBα的磷酸化，水凝胶处理后NF-κB的表达显着下调，CS-B-NO水凝胶通过同时降低磷酸化对NF-κB活化作用，因此具有最有效的抑制效果。以上结果表明CS-B-NO水凝胶保护免受炎症诱导的心脏损伤，很可能是通过抑制NF-κB信号通路的激活和下游巨噬细胞极化和炎症因子表达。

07 CS-B-NO水凝胶通过Nrf2-Keap1信号通路的适应性调节防止I/R损伤后的氧化应激诱导

       Nrf2是一种重要的细胞保护转录因子，前期研究表明通过激活细胞抗氧化机制和抑制促炎信号传导，功能性水凝胶明显降低了I/R损伤后心脏组织中ROS阳性细胞的比例。有报道表明NO通过Keap1的S-亚硝基化激活Nrf2，研究发现在I/R损伤后Keap1S-亚硝基化明显降低，水凝胶处理后Keap1S-亚硝基化的明显增加，Nrf2及其下游靶基因表达上调。总之，使用具有NO输送和H2O2清除双重功能的功能性水凝胶（即CS-B-NO），能够通过增强的S-亚硝基化实现对Nrf2信号通路的有效激活。

08心肌I/R期间CS-B-NO水凝胶介导的心肌保护需要Nrf2

       为了进一步了解NO诱导的Keap1S-亚硝基化激活Nrf2的病理生理学的内在机制，检测了CS-B-NO水凝胶对Nrf2-/-小鼠的氧化和炎症的调节作用。组织学分析显示Nrf2缺乏会加重I/R小鼠的心肌纤维化、炎症反应和氧化应激，功能性水凝胶对NQO1、SOD1和HO-1的诱导在Nrf2-/-小鼠中完全消失，对NF-κB信号通路的抑制作用在Nrf2中也不太明显。通过使用Nrf2抑制剂(ML385)来抑制H9C2细胞中的Nrf2，检测到与Nrf2信号传导相关的抗氧化基因和对应于NF-κB信号传导的炎症基因的表达。结果表明，Nrf2的抑制降低了CS-B-NO水凝胶提供的抗氧化功能和由此产生的心脏保护作用，加剧了NF-κB介导的促炎反应。

总结

       作者团队设计了一种具有剪切稀化特性的新型可注射水凝胶，用于治疗MI（心肌梗死）。在小鼠模型中，将CS-B-NO水凝胶原位注射到缺血心肌中并显示出所需的治疗效果，在I/R损伤的早期可减少肌细胞凋亡并减轻炎症反应，长期治疗可促进心脏修复并改善心脏功能。在机制探究方面，CS-B-NO水凝胶一方面通过增强Keap1S-亚硝基化以激活Nrf2信号通路来保护心脏免受氧化应激；另一方面降低了上游的IKK/IκBα介导的NF-κB信号通路的磷酸化，因此抑制NF-κB信号通路的激活和下游促炎因子的表达；Nrf2的缺失减弱了CS-B-NO水凝胶在体外和体内的抗氧化能力，表明CS-B-NO水凝胶的心脏保护作用是由Nrf2-Keap1防御系统的适应性调节介导的。

点评

       急性心肌梗死(MI)是全球死亡的主要原因。由于NO的多种生理功能，外源性一氧化氮(NO)输送到梗塞心肌已被证明是治疗MI的有效策略。本项研究设计了一种具有清除ROS和释放NO双重功能的新型水凝胶CS-B-NO，这种水凝胶可以调节I/R损伤后的ROS/NO不平衡，从而通过适应性调节核因子-红细胞2相关因子2(Nrf2)来抑制I/R诱导的氧化应激和炎症反应，这项研究为MI的治疗提供了一个可以探究的新的思路和方向。

       （DOI）：https://doi.org/10.1002/advs.202105408