Nature Communications|工程化的CD80变体融合治疗将检查点拮抗与条件性CD28共刺激相结合用于抗肿瘤免疫
发布日期：2022-04-13 浏览次数：3066
肿瘤免疫新疗法
简介
2022年04月04日，生物类期刊Nature Communications（IF=14.919）在线发表了题为“The engineered CD80 variant fusion therapeutic davoceticept combines checkpoint antagonism with conditional CD28 costimulation for anti-tumor immunity（工程化的CD80变体融合治疗将检查点拮抗与条件性CD28共刺激相结合用于抗肿瘤免疫）”的文章。创建一种能够在PD-L1中提供CD28共刺激的治疗剂，同时能够起到拮抗PD-1-PD-L1和CTLA-4–CD80/CD86相互作用，通过结合CD28共刺激和双重检查点抑制。
研究背景
针对CTLA-4-CD80/CD86和PD-1-PD-L1通路的免疫检查点抑制剂(CPI)已在许多癌症中作为单一疗法或联合方案使用，表现出显著的临床活性；但许多患者对CPI没有完全反应，或者观察到的反应由于获得性耐药性的发展而缺乏持久性。
对免疫治疗的原发性和获得性耐药性是深入研究涉及代谢介质的表达增加、抗原呈递和T细胞活化受损、免疫抑制细胞的募集、免疫检查点的调节和受损的IFNγ信号传导等几种肿瘤机制，为了克服这些障碍可能需要针对多种抑制和共刺激途径进行合理设计的药物组合。有前期研究发现，当CD80以顺式与PD-L1结合时，似乎保留了共刺激CD28的能力，同时阻止PD-L1与PD-1的结合，表明这些受体中的每一个的相对表达水平可能有助于APC20的整体共刺激或共抑制活性。
研究思路
- 定向进化CD80
- ALPN-202亲和力验证
- 蛋白结构表征
- ALPN-202的CD28共刺激活性
- 抗肿瘤活性测试
- 机制探究
研究结果
1. 通过定向进化工程化CD80及表征对比
WTCD80细胞外结构域(ECD)由膜近端IgC结构域和远端IgV结构域组成，为了设计对PD-L1具有高亲和力的变体CD80Ig结构域(vIgDs)，通过将CD80 vIgD与不同浓度的CTLA-4、CD28和PD-L1的Fc-二聚体结合来进行分类和选择新变体。鉴定了相对于WT CD80 ECD对PD-L1和CD28具有更高亲和力的仅IgV CD80v IgDFc融合蛋白，并命名为ALPN-202。通过表面等离子共振(SPR)确定ALPN-202与其三种反结构PD-L1、CD28和CTLA-4的结合亲和力并与WT CD80 ECD-Fc进行比较，ALPN-202以比WTCD80更高的亲和力结合PD-L1，推测观察到的ALPN-202与CD28和CTLA-4结合的差异可能是由于去除IgC结构域和在CD28/CTLA-4结合附近的CD80vIgD中包含突变引起的二聚化行为的差异。
2. PD-L1依赖性CD28共刺激的表征
鉴于ALPN-202以比WT CD80 ECD-Fc更高的亲和力结合PD-L1，开发了一种基于人工APC(aAPC)的初级T细胞活化试验，与不同的aAPC共培养原代T细胞表征ALPN-202诱导PD-L1依赖性CD28共刺激的能力。当aAPC仅表达maOKT3时，ALPN-202不会增加T细胞产生的IL-2高于单独的TCR刺激；ALPN-202以与对照CD28激动剂抗体相当的剂量和抗CD3依赖性方式增加分泌和细胞内IL-2以及上调CD25。使用SPR，ALPN-202被捕获到传感器芯片上依次与CD28共注射，在饱和量的CD28存在下结合ALPN-202。单体CD80 vIgD以剂量依赖性方式诱导IL-2，表明CD28共刺激活性。单体CD80vIgD可以同时结合CD28和PD-L1。
3. ALPN-202vIgD:PD-L1复合物的晶体结构
来自ALPN-202的CD80 vIgD与WT PD-L1 ECD共结晶并用于确定CD80 vIgD:PD-L1复合物的结构,该结构显示CD80 vIgD与PD-L1 ECD的IgV结构域相互作用,ALPN-202的CD80 vIgD结构域似乎能够同时结合PD-L1和CD28或CTLA-4，与上述结合和功能活性一致。PD-L1和CD80 vIgD之间的接触面覆盖了PD-L1和PD-1的接触面，展示了ALPN-202如何阻断PD-1-PD-L1结合,PD-L129上的Atezolizumab接触残基表明ALPN-202CD80 vIgD在重叠表位处接触PD-L1。
4. M2c巨噬细胞上的PD-L1使ALPN-202介导的CD28共刺激成为可能
许多肿瘤被CD163+M2c促肿瘤巨噬细胞高度浸润，通过调PD-L1、下调CD80/86、释放免疫抑制细胞因子和代谢改变因子等方式积极抑制抗肿瘤免疫反应。ALPN-202有效地增加了CD4+和CD8+T细胞增殖和IL-2产生，当与抗CD28或抗PD-L1阻断抗体结合时ALPN-202的共刺激活性被显着消除。验证了前期提出的作用机制，增强的反应需要同时结合两种PD-L1和CD28。ALPN-202以剂量依赖性方式诱导升高的IFNγ、IL-2和TNFα比单独的单或双检查点阻断更有效，证明了ALPN-202的CD28共刺激活性。
5. ALPN-202单一疗法在体内显示出有效的抗肿瘤活性
ALPN-202的抗肿瘤活性最初在同基因MC38小鼠结直肠腺癌实体瘤模型中进行了测试，与单独的CTLA-4阻断相比肿瘤生长有小幅但显着的下降。用人类PD-L1(MC38/hPD-L1)稳定地转导MC38细胞，ALPN-202的抗肿瘤活性相对于WTCD80Fc或抗人PD-L1治疗显着提高。为了更全面地了解ALPN-202诱导的肿瘤内变化，在单剂量ALPN-202、抗PD-L1或Fc对照后72小时通过RNAseq分析了MC38/hPD-L1肿瘤上基因表达的变化。ALPN-202治疗的肿瘤显示出与有效T细胞驱动的抗肿瘤反应相关的基因表达增加，树突状细胞和巨噬细胞相关转录物的种类也有所增加。浸润肿瘤抗原特异性CD8+T细胞百分比的剂量依赖性增加，这种效应似乎仅限于肿瘤微环境。
6. PD-L1和CD28结合以实现体内最大的抗肿瘤活性
用ALPN治疗了MC38/hPD-L1荷瘤小鼠-202单独或与小鼠CD28（克隆E18）或人PD-L1（durvalumab）的封闭抗体联合使用，ALPN-202治疗诱导肿瘤生长显著减少，当用抗CD28阻断抗体处理小鼠时未观察到肿瘤生长的显着变化。采用流式细胞鼠的方法分析小鼠肿瘤，与Fc对照相比，ALPN-202显着增加了总T细胞浸润、CD8+T细胞浸润（图6d）和颗粒酶B+CD8+T细胞的百分比，再次表明ALPN-202介导的抗肿瘤活性依赖于PD-L1依赖性CD28共刺激导致T细胞浸润和活化增加。
7. ALPN-202与抗小鼠PD-1合作提高抗肿瘤活性
测试了在MC38/hPD-L1模型中与抗CTLA-4的消耗性或非消耗性变体组合时，虽然惰性Fcm CTLA-4抗体没有抗肿瘤活性，但抗CTLA-4 mIgG2bFc（可介导ADCC）显示肿瘤体积适度减少；ALPN-202的抗肿瘤功效比单独使用任何一种抗体都强，并且当与抗CTLA-4 mIgG2b结合时，这种活性略有增强。将SCC152/PD-L1肿瘤细胞植入免疫功能低下的NSG小鼠体内，并注入E6TCR+T细胞，细胞出现转移后进行给药，ALPN-202给药Q3Dx4显示肿瘤体积显著减小，ALPN-202改善人TCRTgT细胞在体内的抗肿瘤反应。
总结
该项研究使用酵母表面展示定向进化平台选择性地设计CD80IgV结构域以相对于野生型(WT)CD80增加对PD-L1和CD28的亲和力，同时保持结合能力CTLA-4。选定的CD80 IgV结构域和惰性Fc结构域融合成为三特异性治疗剂ALPN-202，能够拮抗CTLA-4和PD-1并传递PD-L1依赖性T细胞共刺激信号，并可能在多种肿瘤适应症中改善CPI护理疗法标准。
点评
PD-1和CTLA-4拮抗剂通过提高DC引发的T细胞启动质量、改善干细胞样T细胞的扩增和“恢复”耗尽的肿瘤抗原特异性T细胞反应，在此基础上寻求开发一种可以结合检查点抑制和T细胞共刺激的治疗实体，以提高抗肿瘤反应的频率和持久性。研究团队生成了一种变体CD80 IgV-Fc蛋白ALPN-202，它对PD-L1的亲和力有所提高，利用了CD80同时结合PD-L1和CD28的独特能力，使ALPN-202能够在单个治疗实体中优雅地结合双重检查点抑制和PD-L1依赖性CD28共刺激。这种组合将产生比单独的检查点抑制更有效、具有临床意义的抗肿瘤免疫。
（DOI）： https://doi.org/10.1038/s41467-022-29286-5
