Advanced Science|人诱导的多能干细胞-心肌细胞分化中天然细胞外囊泡的生物活性和微生物组分析

       2022年03月24日，先进技术类综合期刊Advanced Science（IF=15.8）在线发表了题为“Bioactivity and miRNome Profiling of Native Extracellular Vesicles in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte Differentiation(人诱导的多能干细胞-心肌细胞分化中天然细胞外囊泡的生物活性和微生物组分析)”。研究团队在体外培养多能干细胞诱导分化产生细胞外囊泡（EV），对其进行了生物活性和功能机制的探究，验证了hiPSC可以作为生产EV的细胞工厂，为心脏类疾病的治疗提供了一种新的研究支持。

研究背景

    细胞外囊泡（EV）是细胞自然释放的一种膜包裹的纳米和微粒颗粒，内含多种生物活性分子，根据来源大小可分成囊泡、外泌体和凋亡小体。使用EV作为细胞模拟疗法具有低免疫原性、无肿瘤风险等优势，现有的一些研究表明EV在心脏再生医学领域的应用可能有miRNA相关。miRNA是非编码RNA的小链，根据互补程度与靶mRNA序列的3'-UTR种子区域结合，抑制其翻译或诱导其切割；参与关键的生物学过程，并与细胞增殖、分化、组织发育事件和细胞凋亡有关。

    成年哺乳动物心脏是一个高度结构化的器官，由心肌细胞、成纤维细胞、壁细胞、内皮细胞和免疫细胞组成。在健康的心肌中，心肌细胞被错综复杂的毛细血管网络所包围，毛细血管提供营养、含氧血源以及促进心肌细胞组织和存活的信号。在急性心肌梗塞的发生中，由于该网络的破坏，通常会出现广泛和永久性的肌细胞损失。为了促进心肌再生，EV应该能够通过刺激细胞增殖、激活常驻祖细胞、诱导血管生成、减少纤维化或通过在受伤的心脏中引发修复性免疫反应来增强内源性修复途径。

研究思路

• 诱导hiPSC分化为hiPSC-CM
• 不同来源EV生物活性测试
• 促进血管生成和提高增殖活性
• miRNA测序及差异分析
• AKT途径激活

研究结果

01 EV随着hiPSC向心肌细胞的分化成熟而分泌

       利用标准化的培养技术诱导hiPSC向hiPSC-CM分化，hiPSC对多能性标志物SSEA-4和TRA-1-60呈阳性，对早期分化标志物SSEA-1呈阴性；CMm对cTnT的阳性率超过85%；培养第35天的心肌细胞显示成人与胎儿肌节基因同种型的比例增加，包括分别编码成人/胎儿肌球蛋白重链和心脏/慢骨骼肌肌钙蛋白I的MYH7/MYH6和TNNI3/TNNI1，这些结果证实了CMm的明显成熟特征。在整个培养期间，监测细胞活力以减少凋亡小体对富含小EV的制剂的潜在贡献。对来自每个母细胞的富含EV的8-9级分进行标准粒子表征，纳米粒子跟踪分析(NTA)表明所有样品的典型EV尺寸分布曲线，大多数粒子的直径范围为50-250nm；透射电子显微镜(TEM)分析证实存在具有杯形形态的囊泡并且不存在相似密度的污染物颗粒。

02 EV被心脏和内皮细胞摄取

       为了确定来自四种不同亲代细胞的EV是否具有生物活性,采用PKH26用于标记富含脂质的EV膜并检测它们的内化。为了消除荧光染料形成非EV纳米颗粒的可能性，制备了PKH26标记的PBS对照，并对其进行与EV样品相同的隔离过程。荧光图像显示所有EV组都存在于细胞内，特别是在核周区域，对特定细胞类型没有明显的趋向性。使用Dynasore进行摄取阻断，这是一种GTPase抑制剂，作用于Dynamin-2以防止在Caveolin依赖性内吞/网格蛋白介导的内吞过程中内吞囊泡从细胞膜上脱离，从而抑制受体细胞对EV的内化。添加Dynasore以剂量依赖性方式阻止EV摄取并减少所有EV组的摄取，证实了它们被内皮细胞(HUVEC)和hiPSC-CM摄取。

03 hiPSC-EV比一般EV具有更明显的促血管生成和促增殖活性作用

       为了评估和比较来自四个亲代细胞群的EV的治疗潜力，基于研究背景是由血管化支持的心肌再生来靶向心脏再生，测试了在血管细胞(HUVEC)中诱导血管生成和在hiPSC-CM中增殖的能力。通过管形成和伤口愈合试验评估了EV的体外促血管生成作用。我们观察到，将EV添加到HUVEC会导致形成更长的段和小管并刺激网络形成，节点数量增加；增加了细胞迁移，这种效果在hiPSC-EV治疗组中更快且更大。 为了确认观察到的效果是由于EV的存在，设置一个Dynasore治疗组（阳性对照），显着减少了EV治疗组的迁移但没有阻碍伤口闭合，从而证实了EV活性。在整个伤口愈合试验中，通过EdU掺入监测HUVECs的细胞周期活性排除细胞增殖本身的干扰。

       为了研究了EV是否可以对hiPSC-CM产生促增殖作用，使用hiPSC-和CPC-EV处理时，与单独的培养基相比观察到hiPSC-CM数量增加，通过细胞周期标志物EdU和磷酸组蛋白H3(phH3)测量的细胞周期活性的伴随增加仅支持心肌细胞数量的增加。这些结果表明hiPSC-EV可能促进心肌细胞细胞周期折返。FBS衍生的EV，作为用于心脏再生目的的非相关EV群体在整个生物活性测试中作为对照被包括在内，在任何测定中都无法产生血管生成或促增殖反应，这表明EV活动并不普遍；用于监测EV载体溶液背景信号的车辆控制对所有生物活性测定均无影响，证实了其惰性。

04 EV-miRNA反映了EV分泌细胞的分子特征

       为了探究EV-miRNA货物的光谱并揭示潜在生物活性差异的内容变化，对EV进行了miRNA测序。比较EV组之间的miRNA含量，发现样本内的生物复制之间存在强正相关，表明EV生产和分离运行的一致性。来自不同细胞群的EV的全局miRNA表达存在显着差异，在整个分化过程中也可以观察到一致的模式。使用模糊聚类的处理方法，发现了一个在hiPSC-EV中低表达的miRNA簇在分化后增加，并在整个心肌细胞成熟过程中继续增加，另一个趋势相反的簇；前期研究中在hiPSC、原始分化的中胚层祖细胞和心肌细胞鉴定了类似的表达谱。在EV中观察到的DEmiRNA数量最多，对应于从多能细胞到心脏定型细胞的细胞转变。

05 一个miRNA子集在hiPSC-CM分化过程中在EV中差异表达

       为了描述EV-miRNA表达的情况，研究了在整个心肌细胞分化和成熟过程中作为DE的15种miRNA。K-means聚类出现了三个主要的miRNA子集，分别是主要参与肌肉发育和肥大在心脏中强烈表达的第一簇、在从定型和成熟细胞分泌的EV中下调的多能性相关miRNA第二簇和涉及谱系规范的第三簇。鉴于体外生物活性结果，使用IPA和DIANA-miRPathv3.0来预测受hiPSC-EV影响的细胞通路。对输入miRNA执行直接功能注释，PI3K/AKT通路存在于使用两种靶点预测方法，鉴定的前五个代表的KEGG通路中，并被五个miRNA直接靶向。

06 hiPSC-EV介导受体内皮细胞中的AKT激活

       为了进一步探索hiPSC-EV对心脏再生的影响，在HUVEC上评估了由IPA鉴定的5个直接靶向PI3K/AKT途径的DE miRNA的过表达。通过miRNA模拟物的脂质碱基转染实现瞬时miRNA过表达,在瞬时转染后五种miRNA中只有三种能够对内皮细胞迁移产生显着影响;其中，miR-200c-3p和miR-363-3p直接靶向PTEN mRNA(一种主要的稳态调节剂和肿瘤抑制蛋白)，而miR-302c-3p靶向细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN1A；在转染后24和48小时，相应的mRNA靶标下调。miR-302c-3p也导致PTEN的显着下调，PTEN下调伴随着CDKN1A的抑制和CCND1的上调，作为AKT的下游效应器和细胞增殖的重要调节剂在细胞周期进程中起相反的作用。

       与未处理组相比，用hiPSC-EV处理的HUVEC在24小时后显示PTEN基因表达显着降低，这种效果在蛋白质水平上得到了进一步证实。通过Thr308和Ser473位点的磷酸化水平测量，检测到AKT活性的增加。既hiPSC-EV介导的生物活性至少部分依赖于PI3K/AKT通路的激活

总结

       这项研究提供了在hiPSC向心肌细胞分化和成熟过程中分泌的EV的全面表征。在其分泌的EV中鉴定了涉及hiPSC-CM细胞向心肌细胞定型转变的miRNA谱；证明了hiPSC分泌生物活性EV，富含多能性相关miRNA，和对应物相比具有更高的体外促血管生成和促增殖特性。机制探究实验结果表明，抑制PTEN和激活PI3K/AKT通路可能是参与hiPSC-EV诱导的内皮细胞迁移的细胞信号级联反应的一部分。

点评

      EV在心脏修复过程中发挥重要作用，使它们成为促进心脏再生领域的一种发非常有吸引力的疗法，识别更适合治疗应用的EV和相应的细胞平台和遗传特征的表征至关重要。在这项工作中，作者团队探究了hiPSC-CM分化分泌的EV诱导血管生成和心肌细胞增殖的潜力，作为急性心肌梗死后心脏功能恢复所需的两个关键机制。并且通过结合内皮细胞和心肌细胞的功能测定，发现hiPSC-EV与来自hiPSC心脏定向衍生物的EV相比在体外提供了更高的治疗益处。

     （DOI） :10.1002/advs.202104296