热点技术_RP-ABPP技术构建亲核探针库

热点技术_RP-ABPP技术构建亲核探针库

        蛋白质和小分子（包括抑制剂、激动剂、代谢物和药物）之间的相互作用在生理和病理过程中起着至关重要的作用，基于活性的蛋白质分析 (ABPP) 是一种揭示相互作用的常用技术。

       这项技术由Cravatt课题组首次提出，该方法的核心是设计1个可以在蛋白质组水平上与蛋白活性中心共价或非共价反应的“活性分子探针（activity-based probe，ABP）”。今天我们要介绍的这篇文章就是关于一种RP-ABPP探针的开发。

（简介）

       2022年03月30日，生物化学类顶级期刊J Am Chem Soc(IF=15.419 美国化学学会会志)发表题为“Discovery of Potent and Selective Inhibitors against Protein-Derived Electrophilic Cofactors（针对蛋白质衍生的亲电辅因子的有效和选择性抑制剂）”。作者团队系统开发了一种RP-ABPP探针用于分析扩展的亲核探针库对主链羰基辅因子Glox/Pyvl的反应性和选择性，为开发选择性Glox抑制剂提供了基础。

（研究背景）

       在常见的氨基酸及肽键组合中亲核效应普遍存在，但亲电几乎不存在；通过翻译后修饰（PTM）或者与外源辅助因子的结合获得，能够催化各种复杂反应及调节多种生物学功能。缺电子机制对多种酶的功能机制发挥至关重要，参与代谢、转录调控、染色质重塑等过程，蛋白质结合的辅因子通过与亲核底物的反应来调节相关的生理过程，对于人类蛋白质组中的亲电性反应的认识和理解仍处在起步阶段。

       前期工作提出了基于反极性(RP)活性的蛋白质分析(RP-ABPP)，以使用肼作为内在亲核弹头来发现、分析和抑制细胞中的亲电子辅因子。原型肼探针鉴定了第一个天然存在的N-末端乙醛酰(Glox)修饰对未表征的酶secernin-3(SCRN3)，根据序列预测该酶利用与Glox相同位置的催化半胱氨酸进行水解酶活性，具有末端氢的Glox类似于具有末端甲基的Pyvl，尚未报道天然存在于蛋白质中。这些化学差异带来了关于羰基亲电试剂可以为蛋白质服务的功能以及它们是否可以被小分子选择性靶向的模糊性。

（研究思路）

       文章从结构修饰调节出发，构建了一个小型的亲核分子探针库，随后用探针处理细胞观察其蛋白质组变化，对内源和外源的亲电子试剂进行筛选，最后进行了一定的功能验证。

（研究结果）

01 通过结构修饰调节取代肼与羰基亲电子试剂的体外反应性

       Glox和Pyvl是在SCRN3中发现的两个亲电子试剂，在前期的工作中被捕获为腙。为了解这种捕获机制的化学基础，合成了模拟N端Glox（醛）的小分子亲电子基序和蛋白质中的Pyvl（酮），室温下与过量的肼（1或10mM）反应，通过单指数增长分析吸光度与时间轨迹的关系，分析它们与结构修饰的肼的反应性。

       通过捕获蛋白质组中N端修饰的羰基形成的腙很容易受到蛋白质微环境的影响，试管中小分子模拟物的化学反应可能不适用于SCRN3或细胞环境中主链羰基的酶促反应，先前报道的腙形成的生物学应用很少涉及细胞内相互作用，尚未研究过与主链羰基辅因子（例如脱羧酶中的Pyvl）形成腙的动力学和应用。

02 利用亲核探针库在复杂的的蛋白质组中参与蛋白质靶标作用

       通过反映催化活性位点的保守反应性，可以针对各种酶类对探针进行结构调整。为了全面研究蛋白质组中的功能性亲电子试剂，设计了一个小型亲核探针库的合成方案，其中每个探针都具有一个可变的小分子片段（平均MW∼150Da）、一个炔烃手柄和一个亲核弹头与亲电蛋白中心反应。用探针（1mM）处理HEK293T细胞，原位评估了它们的蛋白质组反应性。利用“click”化学将裂解的蛋白质组与罗丹明叠氮化物(Rh-N3)标签缀合,通过凝胶内荧光扫描进行可视化;在工作条件下,亲核探针处理不会损害细胞活力，由于结构多样性和不同的反应基团，探针显示出明显不同的标记谱，吲哚乙基肼探针(P11)是具有最强标记信号的最具反应性的探针。结果证明，设计的亲核探针库是一个强大且可调节的工具箱，可用于评估蛋白质组中缺电子功能的蛋白质组特异性和反应性。

03 分析细胞中的内源性亲电体

       P11显示出最强的探针标记谱并且显示出剂量依赖性【3A】，采用ABPP-SILAC方法来识别P11的蛋白质组范围的目标，确定其在人类细胞中的蛋白质组学反应性和靶标。P11显着富集的蛋白质被视为潜在的高反应性目标，能够标记已知(SCRN3)或预期(SCRN2)也具有N端亲电体的SCRN蛋白【3B】。与两种基于药物的探针P12/13进行比较的扩展富集分析，具有肼反应性血红素铁辅因子的HMOX2被所有三个探针共享为该细胞系的共同目标【3C】。基于SILAC蛋白质比率，为含有亲电辅因子的探针目标生成了基于活动的热图【3D】。结果表明，不同的探针选择性地捕获具有亲电辅因子的酶，并且SCRN2可能具有与SCRN3相似的修饰（例如，Glox和Pyvl）。P17比P15更强烈地标记SCRN2和SCRN3转染的细胞【3E】，为了检验SCRN2也含有半胱氨酸衍生的Glox和（或）Pyvl基团的假设，通过LC-MS/MS分析来自P17处理的SCRN2转染的HEK293T细胞的加工蛋白质组仅用由P17共价修饰的Cys12衍生的Glox鉴定了探针标记的肽【3F】，验证了在SCRN2中存在亲电N端Glox。

       为了开发Glox和Pyvl选择性探针，用文库中的探针处理过表达的含有Pyvl和Glox的蛋白质（AMD1和SCRN2/3）；数据显示P8对含Glox的SCRN蛋白具有选择性，而大多数肼探针显示出对含Pyvl蛋白（例如AMD1）的更强标记【3H】。P11处理AMD1和SCRN3/2转染的细胞，表现出比参考探针P15更强的SCRN2/3标记；开发抑制剂以调节预期依赖于反应性Glox基团的生物学功能的第一步。

04 使用亲核抑制剂库筛选蛋白质亲电子试剂

       为了筛选潜在的辅因子靶向抑制剂的活性，首先验证了P11的体外标记反应性。在体外抑制剂预处理后P11用于以浓度依赖性方式标记未转染的HEK293T细胞裂解物，1μMP11和1mMP15具有基本相同的效果；通过两种基于凝胶的ABPP在体外有效地标记转染的亲电蛋白和isoTOP-ABPP。

       细胞裂解物用抑制剂预处理后用P11标记，通过凝胶内荧光扫描观察P11标记抑制；筛选了45个小分子(MW:80–300Da)片段亲核试剂【4D】，这些片段根据其结构基序进行分组用于生物连接反应和临床批准的药物。为了对单剂量化合物对Glox/Pyvl靶标进行评估，化合物以相同浓度预孵育30分钟优化浓度。

       基于这些观察，假设对亲电蛋白的有利抑制作用可归因于生物等排性和酶催化等生物因素而不是化学因素（例如电负性）。这些竞争性ABPP数据表明，探针可以阐明对亲电蛋白活性的直接抑制作用，并筛选活性位点定向、辅因子靶向抑制剂的效力和选择性。

05 肼的构效关系研究

       在对文库进行初步筛选后，我们使用竞争性ABPP来测量一组具有代表性的13个肼片段的IC50值，其中一些成为有希望的SCRN3抑制剂的C27、C32和C35（都带苯环）将SCRN3抑制了50-70%（图5A），杂环芳烃的结构就不那么明显。生成的IC50值（图5B-C）反映了基于凝胶的体外标记实验，表明SCRN3的肼抑制作用优于胺或酰胺（C24和C20）取代。对具有三种酶/蛋白质的测试片段进行结构-活性关系(SAR)的详细分析（D），给出取代肼的高电子密度、苯环结构、吸电子基团（EWGs）等建议。

06 体外确认C30是一种有效的SCRN3抑制剂

       为了验证内源水平的SCRN3抑制的相对效力和选择性，通过体外ABPP-SILAC测试了两个代表性的高活性片段萘基C30和吲哚乙基C45。通过LC-MS/MS分析所得肽，C30和C45的蛋白质比率在图中显示，通过芳基C30处理实现了对SCRN3标记的完全抑制，证实了富电子结构对肼与主链羰基亲电试剂的直接极性耦合（DPC）反应性的电子影响及其对SCRN3抑制活性的影响。从化合物库中筛选出的亲核片段能够在蛋白质组范围内选择性地抑制其靶标，从而可以发现针对SCRN蛋白的选择性抑制剂，原则上可以开发出具有独特疾病生物学特性的跨多个酶家族的治疗靶点的共价抑制剂。

 (总结)

       在体外研究了Glox/Pyvl基团的小分子模拟物和亲核肼的化学反应，并确定反应性直接受到肼弹头的α-亲核性的影响。在此基础之上开发出结构多样的亲核RP-ABPP探针库，用于分析和共价抑制人体细胞中依赖于缺电子功能的各种蛋白质活性。利用最高活性的探针筛选一个包含45个亲核片段的文库，以寻找Glox和Pyvl基团的选择性抑制剂进行了初步验证。

（点评）

亲电辅因子在自然界广泛分布，在许多生理和疾病过程中发挥重要作用，但它们仍然是针对亲核试剂的传统基于活性的蛋白质分析(ABPP)方法的盲点。这项研究基于最初的肼探针组开发了一个多样化的功能化亲核探针库，可作为多功能化学工具箱在复杂环境中选择性地靶向缺电子蛋白质活性。在表征可以抑制具有亲电反应性的蛋白质的功能的同时，作为高级和选择性小分子抑制剂的起点，这些抑制剂可调节亲电依赖性功能，用于基础研究和转化研究。

（DOI）https://doi.org/10.1021/jacs.1c12748