蛋白组丨 SSBP1通过激活DNA-PK/p53途径驱动高果糖诱导的肾小球足细胞铁凋亡

蛋白组丨 SSBP1通过激活DNA-PK/p53途径驱动高果糖诱导的肾小球足细胞铁凋亡

副标题：抑制SSBP1可能是治疗肾小球损伤所致足细胞铁凋亡的一种潜在治疗方法

简介：

      2022年3月31日，Redox biology (IF=11.779)发表了一篇题为“SSBP1 drives high fructose-induced glomerular podocyte ferroptosis via activating DNA-PK/p53 pathway”的研究论文。该文章揭示了一种新的抗高果糖诱导的足细胞铁凋亡的干预靶点SSBP1，通过与DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)和P53相互作用来正向调节转录因子P53，促进P53的核积聚，从而抑制高果糖暴露的足细胞中铁凋亡调节剂溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的表达，从而驱动铁性凋亡。本研究确定SSBP1是一种新的抗高果糖诱导的足细胞铁凋亡的干预靶点，提示抑制SSBP1可能是治疗肾小球损伤所致足细胞铁凋亡的一种潜在治疗方法。

1. 背景

       肾小球滤过屏障的功能高度依赖于足细胞。高果糖可导致肾小球损害，并伴有足细胞损伤和蛋白尿。然而，高果糖诱导的肾小球足细胞损伤的原因仍不清楚。

       铁凋亡是一种新的细胞死亡形式，由铁依赖的脂质过氧化引起。铁性凋亡的形态特征明显不同于其他类型的程序性细胞死亡，其典型特征是线粒体膜破裂。溶质载体家族7成员11(SLC7A11)是胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白系统XC−的活性亚基。它的低表达会导致胱氨酸摄取减少，最终导致主要抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)的枯竭。谷胱甘肽被谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)利用来将脂质过氧化氢转化为无毒的脂醇，从而保护细胞，降低铁凋亡。P53是一个关键的肿瘤抑制基因，作为一个转录因子发挥作用。最近的研究表明，SLC7A11是P53介导的转录抑制的靶点

       DNA-PK是DNA双链断裂修复和基因稳定的主要激酶。在高脂肪饮食喂养的非酒精性脂肪肝小鼠中，DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)在S15处磷酸化p53，导致线粒体形态的破坏和功能障碍。

2. 研究思路

①建立高果糖喂养的大鼠模型

②对高果糖喂养组和对照组大鼠肾小球足细胞蛋白质进行质谱分析

③关注到一种显著上调蛋白SSBP1

④在高果糖刺激下的肾小球足细胞中敲除SSBP1，确定了SSBP1可能在高果糖所致的肾小球损伤中触发足细胞铁死亡

⑤通过Co-IP钓取高果糖刺激下的SSBP1结合蛋白，确定p53和DNA-PKcs与SSBP1结合

⑥分别确定了DNA-PK与p53的作用机制和SSBP1与p53结合作用机制

⑦发现蕨类药物可能通过降低SSBP1，抑制DNA-PK/P53通路，减轻高果糖诱导的肾小球足细胞铁死亡

3. 结果

3.1 高果糖诱导肾小球损伤中的足细胞铁凋亡

       据报道，高果糖会引起肾小球损伤，作者建立了一个用高果糖喂养4周，8周，12周和16周的大鼠模型。观察到高果糖刺激的大鼠肾小球和培养的足细胞的细胞死亡(图1A-B)。铁凋亡抑制剂铁抑素-1和铁络合剂去铁胺可以减轻高果糖诱导的培养足细胞死亡(图1C)。在高果糖培养的足细胞中，脂质过氧化的荧光强度增加(图1D)。在高果糖刺激的大鼠肾小球和培养的足细胞中，脂质过氧化的最终产物丙二醛增加(图1E-F)。同时，铁凋亡的蛋白质标志物SLC7A11在体内和体外模型中表达下调(图1G-H)。这些数据表明，在高果糖诱导的肾小球足细胞损伤中，铁凋亡被激活。

图1：高果糖在肾小球损伤中诱发足细胞铁凋亡

3.2 SSBP1在高果糖诱导的肾小球损伤中引发足细胞铁凋亡

        为了确定与高果糖诱导的肾小球损伤有关的关键蛋白质，作者使用基于质谱iTRAQ的定量蛋白质组学方法分析了大鼠模型的肾小球，主要对12周和16周这两个时间点的动物模型进行研究。与对照组相比，在高果糖饮食组的数百个有显著变化的蛋白中，我们重点关注了在第16周果糖饮食的大鼠肾小球中显著上调(图2A-B)的蛋白SSBP1。SSBP1的蛋白通常在肾小球的三种主要细胞类型中表达，但SSBP1仅在高果糖培养的足细胞中特异上调(图2C)。根据质谱iTRAQ和免疫印迹结果，在高果糖刺激的大鼠肾小球和培养的足细胞中也观察到SSBP1 mRNA水平显著上调(图2D-E)。作者用特定的引物检测了mtDNA的含量发现，与对照组相比，高果糖暴露的大鼠肾小球和培养的足细胞mtDNA拷贝数显著减少。为了进一步探讨SSBP1在高果糖诱导的肾小球足细胞铁凋亡中的作用，将SSBP1 siRNA导入培养的足细胞，然后与高果糖共同孵育发现，在高果糖培养的足细胞中，SSBP1被敲除显著增加了SLC7A11的蛋白表达(图2F)。在高果糖培养的足细胞中，SSBP1的缺失降低了脂质过氧化和丙二醛(图2G-H)。在这个细胞模型中，SSBP1基因敲除也减少了铁链细胞的死亡(图2I)。

       因此，SSBP1可能在高果糖所致的肾小球损伤中触发足细胞铁凋亡。

图2：SSBP1 在高果糖诱导的肾小球损伤中引发足细胞铁凋亡

3.3 SSBP1与P53相互作用并促进P53 S15的磷酸化，从而增加高果糖刺激的肾小球足细胞铁凋亡中P53的核内积聚

       接下来作者探讨SSBP1诱导铁性凋亡的可能分子机制，对高果糖培养的足细胞中SSBP1结合蛋白进行了研究。确定了SSBP1蛋白复合体Co-IP中的p53和DNA-PKcs。作为调节SLC7A11的上游转录因子，P53与SSBP1的相互作用在高果糖培养的足细胞中用Co-IP后针对P53的抗体进一步证实(图3A)。接下来，作者研究了SSBP1是否调节足细胞中P53的表达。SSBP1的过表达或下调对培养的足细胞的P53 mRNA水平没有显著影响(图3B-C)。SSBP1过表达显著增加总P53蛋白的表达，而在SSBP1缺失的足细胞中观察到相反的作用(图3D-E)。作者还观察到高果糖暴露的大鼠肾小球和培养的足细胞中总P53的上调(图3F-G)。据报道，p53占据了SLC7A11基因的启动子区域，介导转录抑制。因此，作者评估了P53是否积聚在细胞核中。Western印迹分析显示，在高果糖刺激的大鼠肾小球和培养的足细胞中，核P53的水平相对较高(图3H-I)。免疫荧光染色显示高果糖刺激的P53核聚集，也显示SSBP1和P53蛋白在高果糖暴露的足细胞中共存(图3J)。由于P53的翻译后修饰可以调节其核进出口，随后检测了P53的磷酸化。观察到，在高果糖暴露的大鼠肾小球和培养的足细胞中，P53 S15的磷酸化显著增加(图3K-L)。对转Myc-Wt P53或Myc-Mut P53的培养足细胞进行的核/胞质分离分析表明，P53 S15的磷酸化对其在高果糖刺激或无高果糖刺激下的核转位至关重要(图3M)。因此，作者确定了在高果糖培养的足细胞中，SSBP1基因的敲除降低了P53 S15的磷酸化水平，并抑制了P53核的聚集(图3N-P)。

       这些数据表明，SSBP1可能通过促进高果糖刺激的肾小球足细胞铁凋亡中P53 S15的磷酸化而促进P53移位到细胞核中。

图3：SSBP1与p53相互作用并促进p53 S15磷酸化，以增加高果糖刺激的肾小球足细胞铁凋亡中核p53的积累

3.4 SSBP1激活DNA-PK磷酸化P53在高果糖诱导的肾小球足细胞铁凋亡中的作用

       为了探究S15是哪一种激酶使P53磷酸化，通过蛋白质Co-IP与SSBP1的质谱分析表明，在高果糖培养的足细胞中，使用Co-IP后针对DNA-PKcs的抗体证实了DNA-PKcs与SSBP1的相互作用(图4A)。SSBP1在培养的足细胞中的过表达显著增加了DNA-PK活性和DNA-PKcs的磷酸化(图4B-C)。SSBP1基因敲除可降低培养足细胞DNA-PK活性和DNA-PKcs磷酸化(图4D-E)。随后观察到，在高果糖暴露的大鼠肾小球和培养的足细胞中，DNA-PK活性和DNA-PKcs磷酸化同时上调(图4F-H)，这一上调可被siRNA抑制SSBP1(图4F-H)所逆转(图4I-J)。在培养的足细胞中作者单独或联合瞬时表达了Flag-SSBP1、Myc-P53和HA-DNA-PKcs，并进行了Co-IP分析，发现DNA-PKcs与SSBP1和P53强健共洗脱(图4K)。因此，作者重点研究了DNA-PK在高果糖诱导的足细胞损伤中P53调节的铁性凋亡中的作用。DNA-PK抑制剂LTURM34可减弱果糖诱导的P53磷酸化和核P53蛋白水平的上调(图4L-M)。在高果糖培养的足细胞中，LTURM34抑制DNA-PK一贯上调SLC7A11蛋白水平(图4N)，并增加GSH，降低脂质过氧化和丙二醛(图4O-P)。随后，DNA-PK抑制减少了高果糖暴露的足细胞中铁链细胞的死亡(图4Q)。

       因此，DNA-PK可能通过磷酸化高果糖诱导的肾小球足细胞损伤中的P53，参与SSBP1所致的铁凋亡图4：SSBP1激活DNA-PK以磷酸化高果糖诱导的肾小球足细胞铁凋亡中  

图4：SSBP1激活DNA-PK以磷酸化高果糖诱导的肾小球足细胞铁凋亡中的p53

3.5  SSBP1被紫檀芪抑制抑制DNA-PK/p53通路，缓解高果糖诱导的肾小球足细胞铁凋亡

       接下来，作者研究了抗氧化剂二苯乙烯是否可以缓解足细胞铁凋亡。在高果糖刺激的大鼠肾小球和培养的足细胞中，蕨类显著降低SSBP1、p-DNA-PKcs(S2056)、p-P53(S15)和P53的蛋白水平，并上调SLC7A11的蛋白水平(图5A-B)。在体内和体外模型中，蕨类一贯提高GSH，降低脂质过氧化和丙二醛(图5C-E)。随后，高果糖诱导的大鼠肾小球和培养的足细胞的细胞死亡被二茂铁减轻(图5F-G)。

       吡格列酮是一种过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂，被认为可以抑制肝细胞癌细胞的线粒体铁摄取、脂质过氧化和随后的铁凋亡，并防止足细胞损伤，作为阳性对照。吡格列酮在体外和体内模型中发挥了类似的作用(图5A-G)。

       这些结果表明，蕨类可能通过降低SSBP1，抑制DNA-PK/P53通路，减轻高果糖诱导的肾小球足细胞铁凋亡。

图5：SSBP1被紫檀芪抑制以抑制DNA-PK / p53途径以缓解高果糖诱导的肾小球足细胞铁凋亡

4. 总结

       这项研究证明了高果糖在肾小球损伤中引发足细胞铁凋亡。此外，在高果糖诱导的肾小球损伤中，SSBP1通过激活DNA-PK/P53通路诱导足细胞铁凋亡。因此，这项研究为高果糖诱导的铁性细胞死亡提供了一种新的靶向策略，并提示二苯乙烯类化合物抑制SSBP1可能是治疗高果糖诱导的足细胞铁死亡的一种潜在方法。

点评：

       目前某些疾病的发生机制或者疾病与疾病之间的关联是研究热点，发现疾病机制是找到治疗疾病的靶点或者研发药物的基础，具有很重要的实际意义。这篇研究以蛋白质组学等方法为技术手段，筛选出了SSBP1并发现了DNA-PK/P53通路，对后续对高果糖诱导的肾小球足细胞损伤的治疗有重要的临床意义。探究过程清晰明了，循序渐进，为后续使用蛋白质组学方法找到某几种疾病之间的关联，乃至于找到关键作用位点提供了参考。

· DOI: 10.1016/j.redox.2022.102303