中药基因组文章集/多组学联合分析本草基因组学( herbgenom- ics) 的研究范畴、研究思路、具体研究内容

中药基因组文章集/多组学联合分析本草基因组学( herbgenom- ics) 的研究范畴、研究思路、具体研究内容

       2000 年提出了中药基因组学( TCM genom- ics) 的概念，即以药物基因组( pharmacogenomics) 理论为基 础，将中药的药性、功能及主治与其在人体内代谢/疾病相关 基因表达调控相关联，在分子水平研究中药在人体基因组介 导下的代谢转化、作用靶点、毒副反应、药效机制和中药整体化作用的规律。中药基因组学的核心内容是应用基因组信 息和方法在人类基因组水平研究中药体内代谢和反应的遗 传学本质。中药基因组学的理解，则侧重于 中药本身，主要包括中药转录组学、结构基因组学、基因组标记解析和功能基因组学等，属于本草基因组学( herbgenom- ics) 的研究范畴，旨在通过对中药原物种遗传信息的揭 示，解析重要活性产物的生物合成途径，发掘参与生物合成的功能基因，推动对中药合成生物学、基因组辅助分子鉴定和分子育种及中药道地性遗传机制阐释的深入研究。下面给老师分享几篇本草基因组学的研究案例。

研究思路

       备注：红色实线区块为必做部分、蓝色虚线区块为选做内容

案例一

题目：铁皮石斛染色体水平参考基因组组装及其在功能基因组学和分子育种研究中的应用

        本文是南京师范大学生命科学学院和江苏省石斛产业化技术工程中心发表在《Acta Pharmaceutica Sinica B》题为“The chromosome-level reference genome assembly for Dendrobium officinale and its utility of functional genomics research and molecular breeding study”的文章。

导语

       铁皮石斛是兰科石斛属的重要药用植物，作为中药已有近千年的历史。中国约有120种，其中许多生长在非常严格的条件下，如悬崖或树干上的附生植物，分布在海拔1200 m1e3以上的高空。为了增强对恶劣环境的抵抗力，石斛兰花积累了大量的次生代谢产物，其中一些是药用植物中重要的活性成分，如多糖、生物碱、黄酮、萜烯、苄基化合物。石斛兰花中含有丰富的活性成分，具有良好的药用价值，如益胃、抗癌、增强人体免疫力等。，石斛属植物有许多相似的形态特征，导致其分类和分类鉴定的混乱，虽然许多石斛属植物被用作中药已有很长时间，但石斛属植物活性成分合成的分子机制仍不清楚。

组装策略：PacBio 108X （131.1 Gb）、Illumina 110X（125G）、 Hi-C 100X、REN-seq、GWAS 8X(9.5G)

结论

       组装注释了铁皮石斛的基因组，基因组大小为1.23G，N50 为1.44MB，完整度为93.5%，有19条染色体，76.77%的组装序列为重复序列，转座因子（TE）占铁皮石斛基因组的76.77%，其中59.72%为LTR因子，27,631个蛋白编码基因。注释基因的平均基因长度和编码DNA序列（CDS）长度分别为17023和1086 bp。

       铁皮石斛比较基因组学分析发现27631个基因聚成13903个基因家族，12398个基因家族在兰科中共有，1196个为铁皮石斛特有。

       13个物种的1456个单拷贝基因进行进化树分析ml 树显示兰花物种存在一个单系群，与P . equestris为姐妹群，分歧时间在66.4百万年前。共线性基因之间的Ks值发现在0.05/0.84/1.50处有峰值表明发生了三次WGD事件。LTR转座子插入时         间分布显示最近发生了大量插入导致独立峰值，说明在前两轮之后铁皮石斛没有经历独立的WGD事件。

       基因家族收缩扩张分析发现820个基因发生了扩张，975个发生收缩。主要是次生代谢类多糖、生物碱、类黄酮等生物合成家族发生扩张。比如戊糖和葡萄糖醛酸转化，淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、异喹啉生物碱合成还有光合作用基因家族。

       快速进化基因和正选择表明一些与要用植物活性成分合成光合作用有关关键酶基因。确定了268个多糖生物合成相关的基因，98个生物碱、52个类黄酮合成基因。、56个与倍半萜生物碱等。

       SA 处理35天后多糖生物碱黄酮含量发生变化转录组分析差异表达显示1677个DEG 中772个上调，965个下调，107个与活性合成有关，其中51个与多糖生物碱类黄酮有关，其中花青素合成相关基因上调，鉴定156个转录因子。

细胞器色素CYP450基因家族本研究中218个CYP 450该家族分为9类，对其进行系统发育选择CYP71中13个家族128个基因。根据处理组和对照转录组分析发现29个差异表达的CYP450，其中26个CYP71中17个上调，倍半萜和三萜相关的CYP71 1个，4个CYP75A和6个类黄酮生物相关。

       13个地区38个铁皮石斛个体和5个相关物种代表中国铁皮石斛物种大多数表型和遗传多样性，筛选出396万个SNP ，其中有198万个高质量的SNP。六个群体个体的PGA 分析，鉴定出13个GWAS，已鉴定的GWAS 基因座包括：4个株高基因，两个叶长性状，3个茎叶表性状，1个节间长度性状。其中MWL1基因负责细胞壁生长，促进株高生长可能有助于植物产量。

       文章链接：https://doi.org/10.1016/j.apsb.2021.01.019

案例二

       本文是安徽农业大学韩国民 老师发表在《The Plant Journal  》题为“The chromosome-scale reference genome of Rubus chingii Hu provides insight into the biosynthetic pathway of hydrolyzable tannins”.文章组装了掌叶覆盆子的基因组，基因组大小为231.21Mb预测了33130个蛋白编码基因，其中89.28%为功能基因。系统进化树表明与 Rubus occi-dentalis亲缘关系较近，形成于22.46 百万年前。比较基因组学发现在二号染色体上存在UGT、羧酸酯酶（CXE）和SCPL基因的串联基因簇，他们可能是合成水解单宁。体外酶分析，CXE（LG02.4273）和UGT（LG02.4102）基因编码的蛋白质分别具有单宁水解酶和没食子酸糖基转移酶功能

研究策略：采集了不同发育阶段和不同组织的所有样本 叶、茎、花、根、小果、成熟水果用于转录组测序和多酚化合物分析 。全基因组DNA是从单一植物的叶片中提取， Oxford Nanopore测序，Illumina,测序。转录组测序Illumina 测序，

结论

       掌叶覆盆子变种kmer分析显示其基因组大小约为239.4 Mb，杂合性为0.80%，是一个高度杂合的基因组。平均GC含量为36%。Oxford Nanopore测序 24.8 Gb（100X），序列平局长度18.7 kb，N50长26.2 kb。最长的序列为26.2 kb。组装出来约233.9 Mb， scaffold N50 of 8.2 Mb。BUSCO预测97.1%。Hi-C 测序231.21 Mb挂载到7条染色体上。基因组注释了 1 817 604SSR（36.47%），TEs占基因组的17.70%， LTR/Gypsy占7.64%， LTR/Copia 占4.38%

       掌叶覆盆子与其他15个物种蛋白组比较分析发现，获得21686个同源基因家族，包含470865个基因，16个物种共有6976基因家族252357个基因，19个基因家族4736基因为掌叶覆盆子特有。系统发育关系表明16个代表性植物最新共同祖先中推断21620个基因家族中，1594个家族在掌叶覆盆子基因组中收缩，1538个家族获得了新的基因拷贝。研究确定了18578个重复基因，56.1%为假定的蛋白质编码基因。发现了Ks=1.48处的全基因组复制事件。

       共鉴定出61种多酚（图4a、b和表S17）：29种HTs、15种黄酮类、11种酚酸、五种缩合单宁和一种花青素，除花青素外，所有物质均以负电离模式检测。HTs是最丰富的多酚 ，有些在整个植物中都能找到，而另一些只在特定的组织中积累。叶片中存在多达20种HTs，而茎中仅发现10种不同的HTs。四或五加仑基葡萄糖仅在叶片中检测到，而三加仑基HHDP葡萄糖和甲基化\酰化鞣花酸分别仅在果实和根中检测到 在掌叶覆盆子中发现了一个由CXE、UGT和SCPL基因组成的串联簇，该簇在2号染色体上聚集在27.30到29.22 Mb之间。

       从分布来看，这三个基因簇是串联排列的，前面有11个CXE基因，后面是8个UGT基因和6个SCPL基因 共线性分析显示与R. occidentalis有2.18 Mb的同源片段，在R. chingii中可能发生了扩张，该片段由7个CXE基因、12个UGT基因和6个SCPL基因组成。基因簇中的16个基因在成熟果实中的表达水平最高，包括6个CXE基因、4个UGT基因和6个SCPL基因 同时，四个基因在根（R）中的表达水平最高，包括三个CXE基因和一个UGT基因 。为了进一步评估HTs含量与该片段中基因表达水平之间的关系，进行了相关矩阵分析，几种CXE和UGT基因与HTs含量呈高度或中度正相关。对大肠杆菌中高表达基因LG024102（CXE基因）和LG024273（UGT基因）蛋白质产物进行体外酶分析，LG024273重组蛋白具有糖基转移酶活性，并能催化没食子酸生成b-葡萄糖没食子酸。LG024102具有单宁水解酶活性，能催化1,2,3,4,6-开他甘醇葡萄糖水解产物的形成。

研究意义

       通过比较基因组和代谢物分析研究了HT生物合成的潜在遗传基础 相关转录组分析和重组蛋白活性分析进一步证实，该聚集簇参与HTs的生物合成。

案例三

题目：利用nanopore technology重新组装药用植物地黄基因组

       本文是河南中医药大学发表在《 Computational and Structural Biotechnology Journal 》题为“De novo genome assembly of the potent medicinal plant Rehmannia glutinosa using nanopore technology”.

导语

       地黄被列为中国传统医学的50种基本草药之一，是一种有效的药用植物，在中药中具有重要意义。其根富含以环烯醚萜类为主的多种生物活性分子，具有重要的药用特性。地黄主要药用组织是块根，用于治疗热和增强身体的张力。根据体外试验，它对心血管系统、中枢神经系统、免疫系统和内脏系统也有显著影响。已报道了几种具有重要药理活性的生物活性化合物，包括环烯醚萜类化合物，尽管这些生物活性化合物具有有益的性质，但由于缺乏高质量的基因组资源，其形成的分子机制尚待阐明。对药用植物基因组进行测序和研究对于阐明其系统发育关系、促进其可持续开发和促进基于植物的药物发现至关重要，在研究重新测序并组装了地黄的一个参考基因组。

研究策略：Oxford Nanopore 3 flow cells（297.86 Gb）；Illumina 72x （170.32 Gb）；Hi-C；幼叶、成熟叶、茉莉酸处理的叶和根、水杨酸处理的叶和根的 Illumina RNA-seq

结论

       本研究结合Illumina、Nanopore和Hi-C对黄连进行基因组从头测序，最终获得2.49 Gb的染色体级别高质量的同源四倍体地黄基因组，其组装contig N50和Scafford N50分别为658 Kb和70 Mb，GC含量为36.52%。基因注释获得48475个蛋白编码基因。地黄基因组中重复序列比例较高，占整个基因组的67%以上，其中LTR（45%），特别是Copia（31%）发生了显著的扩张。

       地黄与透骨草科植物Erythranthe guttata亲缘关系最近，而透骨草科与列当科进化关系比较近，推断地黄隶属于列当科（Orobanchaceae）而非玄参科（Scrophulariaceae）。同时，地黄中有6237个基因家族经历了扩张，848个基因家族经历了收缩，其中扩张的基因家族主要富集在类异戊二烯生物合成。

       地黄的全基因组复制分析表明地黄在364万年前发生了一次独立的全基因组复制事件。

       在本研究中，共鉴定出313个候选基因涉及环烯醚萜生物合成途径，属于25个基因家族。利用根和叶组织的转录组数据，共检测到137个差异表达基因，与幼根相比，大部分基因在地黄老根中表达上调，而在叶组织中表达下调，这表明环烯醚萜类化合物主要在地黄的根中富集。

       地黄的TPS基因家族扩张主要是TPS-a 和 TPS-b 亚家族。通过与拟南芥比较发现了几个TPS基因簇可能在地黄的环烯醚萜的生物合成中起主导作用。

       TPS基因在不同品种、生长期、组织(根和幼苗)、根部(径向条纹和非径向条纹)和水杨酸处理的表达分析中发现，大部分TPS基因在根组织中高表达，而在幼苗中表达较少，这与地黄根中环烯醚萜含量较高一致。而水杨酸处理刺激TPS基因的表达，可能有助于环烯醚萜的高积累。

       在地黄中，糖基化在环烯醚萜的生物合成中起着至关重要的作用。在地黄中共检测到333个UGTs基因，在地黄的根和幼苗中高表达。

研究意义：

       本研究为地黄在列当科中的分类地位提供了强有力的分子证据，为地黄高产品种的基因功能鉴定和分子育种提供重要依据。

       文章链接：https://doi.org/10.1016/j.csbj.2021.07.006

案例四

题目：北马兜铃染色体水平的基因组组装为苄基异喹啉生物碱和马兜铃酸的生物合成提供了新的视角

       本文是中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所卢善发课题组发表在《Horticulture Research》题为Chromosome-level genome assembly of Aristolochia contorta provides insights into the biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids and aristolochic acids的研究论文。

导语

       马兜铃酸及其衍生物存在于多个马兜铃科物种中，这些物种曾经或正在被用作药用材料。在过去的几十年里，马兜铃酸由于其肾毒性和致癌性而受到越来越多的关注。利用生物技术方法消除药用材料中的马兜铃酸对提高药物安全性非常重要。然而，由于现有了解的马兜铃酸生物合成方面的信息有限，这一点还没有实现。在此，我们报告了一个高质量的含马兜铃酸的藤本植物北马兜铃（Aristolochia contorta）的参考级基因组组装。

结论

       组装的总大小为209.27Mb，包含7条染色体序列。共线性、Ks和4DTv分析表明，在被子植物共有的全基因组复制事件之后，北马兜铃中不存在新的全基因组复制事件。基于基因组、转录组和代谢数据，我们提出了北马兜铃中的苄基异喹啉 生物碱和马兜铃酸生物合成的途径和候选基因。我们克隆了五个O-甲基转移酶基因，包括AcOMT1-3、AcOMT5和AcOMT7，并对其功能进行了鉴定。这些结果为马兜铃科含马兜铃酸的物种提供了一个高质量的参考基因组。它为进一步阐明马兜铃科药用植物的马兜铃酸生物合成和调控以及分子育种奠定了坚实的基础。

       基因组信息，结合转录组和代谢组数据，鉴定了北马兜铃中苄基异喹啉生物碱生物合成的关键酶基因，分析了基因的表达模式，绘制了苄基异喹啉生物碱合成的代谢通路图，推测了马兜铃酸的生物合成通路（图2）。此外，还从全基因组水平系统鉴定了AcOMT和AcCYP基因家族，验证了关键酶基因Ac6OMT的功能。北马兜铃参考基因组为北马兜铃药效物质及马兜铃酸生物合成途径的解析奠定了基础，有望加速马兜铃酸类药材药用活性成分合成生物学和马兜铃酸减毒去毒方面的研究。

       文章链接：https://doi.org/10.1093/hr/uhac005

案例五

题目：流苏马兜铃基因组对被子植物进化、花发育和化学生物合成的研究

        本文是中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室发表在《Nature Plants》题为“Insights into angiosperm evolution, floral development and chemical biosynthesis from the Aristolochia fimbriata genome”的文章。

导语：

       马兜铃属（Aristolochia fimbriata）是木兰纲胡椒目的植物，几个世纪以来以其高度特化的花朵和广泛的药用价值而闻名。最近的研究表明，马兜铃属植物自然产生的一类硝基菲羧酸，称为马兜铃酸（AAs），对人类具有高度的肾毒性和致癌作用。然而，AAs的确切生物合成途径仍然未知。总的来说，这些特征证明了马兜铃属物种作为植物进化发育生物学和药用植物研究的有价值的模型系统的重要性。因因此测序组装了流苏马兜铃的基因组

结论：

        OxfordNanopore、Bionano 、Hi-C 测序组装 A.fimbriata的基因组大小为258Mb。N50为12.9 Mb，杂合性（~0.07%），Hi-C，scaffolds被进一步锚定到七个假染色体上，覆盖了约 95% 。注释了21751 个PCG 基因，19582个为高置信度基因，转座因子（TE）约占基因组的52.1% ，LTR为 38.2%，Ty3\/Gypsy基因占21.3%，而Ty1\/Copia基因占基因组的4.6%。

       对无WGD的无油樟以及具有一个谱系特异性、WGD的睡莲 (Nymphaeacolorata) 进行了基因组间比较。通过将 A. fimbriata的基因组与黑胡椒（Piper nigrum；Piperaceae）的基因组进行比较，发现了 1 到 8 个保存完好的基因组间共线块，表明黑胡椒中连续三轮谱系特异性WGD。此外，确定了A. fimbriata 和鹅掌楸（L. chinense）之间的共线深度比为1:2，和沉水樟Cinnamomum kanehirae （樟科）之间的共线深度比为1:4，从而证实了之前报道的中的单一WGD，以及自木兰类植物分化以来的C. kanehirae中的两轮WGD

        将 A. fimbriata基因组与代表性木兰科植物、真双子叶植物和单子叶植物的基因组进行比较，以确定相关的基因组重排是否由两个或所有三个近被子植物进化枝共享。结果表明染色体重排事件是由木兰类和单子叶共享，可能与eudicots不共享。木兰科植物和单子叶植物分化之前，祖先的染色体就已经融合。祖先染色体结构的重建意味着B1-B2和C1区域之间的基因组交换发生在单子叶植物和木兰类植物分化之前。木兰类植物和单子叶植物中共享的、衍生的（同质性的）染色体排列，在真双子叶植物中缺失，为以真双子叶植物作为其姐妹谱系的木兰+单子叶植物进化枝提供了支持。

       利用序列建树看主要被子植物群之间关系。从22 个代表性物种中鉴定了 98 个严格单拷贝（SSC）和 535 个主要是单拷贝（MSC）基因家族。98个SSC和535个MSC基因家族的氨基酸序列、蛋白质编码序列、分区密码子的各种数据集，基于串联的推断始终支持木兰科和真双子叶植物作为姐妹关系。作者结合基因组结构证据和系统发育基因组学结果，提出T3拓扑结构可能是一个值得进一步研究的关系。

       通过分子测年，发现真双子叶、单子叶和木兰类植物之间分化的时间接近(在7ma 以内)，分化时间的置信度范围广泛重叠表明物种快速分化。快速分化可能是使用基于序列数据的基因组方法重建这种关系的巨大困难的原因。

       马兜铃属植物具有独特的花形态，由单对称、喇叭状、花瓣状的花被和雌蕊组成，合蕊柱由雄蕊和心皮柱头区的先天融合形成。流苏马兜铃基因组包含相对较少的花调控基因，八类花器官鉴定基因中的每一类只有一个同源基因，与无油樟（Amborella）中相应的同源物高度相似。研究发现，MADS-box基因编码了一个大的转录因子家族，它参与了植物、动物和真菌的不同发育过程。

       在花器官识别基因中，AfAP3和AfPI在花被中高度表达，表明花被的花瓣状是由B功能基因的表达域向外扩展引起的，并支持流苏马兜铃花萼衍生花被的假说。B功能基因和AfAG均在合蕊柱中表达，支持合蕊柱是融合结构的假设。2个CUC基因：CUC基因属于NAC转录因子，是花器官融合的关键决定因子。1个CYC基因和3个CIN：是其他物种中花对称性建立和叶状器官形态发生基因的同源基因。CHS, F3H,DFR和ANS: 在开花前的花朵中表现出相对较高的表达。三个结构基因（F3H、DFR 和 ANS）和一个调控基因（TT8)共同调节花青素的生物合成）。B 功能基因（AfAP3 和 AfPI）与三个结构基因（F3H、DFR 和 ANS）和一个调节基因（TT8）的共线性。

       流苏马兜铃很可能缺乏基于飞燕草苷的花青素，因为没有一个已确定的候选基因编码类黄酮3′5′-羟化酶（F3′5′H），类黄酮3′5′H是合成基于飞燕草苷的丁香到蓝色花青素的关键酶。

       在 A. fimbriata基因组中，注释了属于约 20 种次级代谢途径（包括异喹啉生物碱生物合成、酪氨酸代谢和其他生物碱生物合成途径）的 1,803 个基因。作者对流苏花开花时挥发物做了的气相检测，但在流苏马兜铃中没有检测到二萜类化合物（绿色：脂肪酸衍生物；蓝色：苯类化合物；橙色：萜类化合物（倍半萜和单萜）内标物（IS）：3-辛醇）。

       作者鉴定了41个TPS（萜烯合成酶）候选基因，发现流苏马兜铃中的一个主要倍半萜合酶编码基因（Af06G158900）在开花的胞囊中表现出极高的表达，这与在开花挥发物中检测到的倍半萜的丰富成分一致。TPS-c和TPS-e/f分支中负责二萜类生物合成的基因在开花前和开花后的花中都表现出非常低的表达。正是这些基因的低表达导致流苏马兜铃挥发性化合物中缺少二萜类化合物。

       马兜铃科许多常见药用植物中存在的主要有毒生物碱化合物，作者还探索了流苏马兜铃基因组组装。基于液相色谱-质谱（LC-MS）的方法确认流苏马兜铃中AA化合物（AAI）的积累后，在之前研究的基础上构建了AAI生物合成途径，并确定了涉及的主要酶。

研究意义

       A. fimbriata基因组除了所有现存的被子植物共享的WGD 之外，缺少任何额外的WGD。因此，它为比较基因组学和推断祖先被子植物基因组以及其他被子植物基因组进化的模式和过程提供了一个杰出的新进化参考。A. fimbriata的基因组结构变化，表明木兰科植物和单子叶植物之间存在姐妹关系。A. fimbriata基因组为研究其特异性花发育和马兜铃酸的生物合成途径提供了遗传基础。

       文章链接：https:/ / doi.org/10.1038/ s41477-021-00990-2