Nature重磅|ABO基因型通过调节猪体内GalNAc水平改变肠道微生物群

Nature重磅|ABO基因型通过调节猪体内GalNAc水平改变肠道微生物群

       肠道微生物组的组成因人而异，并且与健康相关。了解宿主遗传学在何种程度上以及如何促成这种变异至关重要，但事实证明这是困难的，因为很少有关联被复制，特别是在人类中。人们越来越认识到，全面了解生物体的生理学和病理学需要对宿主及其多种微生物群进行综合分析。在人类，肠道微生物群组成与生理和病理参数相关，包括HDL胆固醇、空腹血糖水平和体重指数（BMI）。在家畜中，瘤胃微生物组分与甲烷产量和饲料效率有关。这些相关性反映了宿主和微生物群之间复杂的相互作用，其中可能包括微生物群对宿主生理的直接（“因果”）影响。

       2022年4月27日，江西农业大学黄路生，陈从英及Michel Georges共同通讯（杨慧及吴金鸳为共同第一作者）在Nature 在线发表题为”ABO genotype alters the gut microbiota by regulating GalNAc levels in pigs“的研究论文，该研究探索了宿主基因型对猪肠道微生物群组成的影响。该研究表明，在遗传多样性和环境均匀性加剧的条件下，微生物群组成和特定类群的丰度是可遗传的。

       该研究以家猪为研究材料，为了增加宿主个体的遗传变异，研究人员首先利用4个中国种猪和4个西方种猪共61只F0杂交后代，经过10代以上获得了超过7500只杂交猪构成的群体。通过严格控制饲料、饲养、健康及环境条件，测量了954只F6和892只F7超过200种表型数据（与身体组成、生理、抗病和行为有关）、转录组、表观组、染色质互作组、代谢组和微生物组，并对F0、F6和F7进行了全基因组重测序，F0平均测序深度为28.4X，F6和F7平均测序深度为8.0X。

结果

一、健康猪的肠道微生物群

       在第25天（哺乳期）、120天（生长期）和240天（屠宰日）收集粪便，以及在第240天收集盲肠和回肠内容物（F6和F7），盲肠和回肠粘膜刮片（仅F7）（7种样本类型，12个数据系列）进行16S rRNA（V3-V4）测序。12054个OTUs注释到41门87纲149目207科360属150种。12个数据系列的平均微生物群组成表明F6和F7之间具有显著的一致性，但样本类型之间存在显著差异。证明肠道菌群的组成、丰度具有生长阶段和肠道部位的广泛特异性及多样性。而与小鼠粪便相比，猪D240粪便的微生物群组成更类似于人类粪便。

健康猪的肠道微生物群。（a）16S rRNA测序PCoA分析；（b）12个数据系列的平均微生物群组成，门和门内科着色的分类群，在至少一个数据系列的前15名中突出显示了43个科。（c） α-多样性（香农指数）。（d）β-多样性（Bray-Curtis距离）。

二、猪肠道菌群组成及丰度的可遗传性

       为缓解遗传学和环境的干扰，对局限于同一环境下饲养的全同胞产仔配偶，以及F6和F7两个世代遗传相似性和微生物群差异性进行分析。这两种方法都支持遗传对微生物群组成的影响，表现为遗传相似性和微生物群差异性之间的显著负相关。评估taxa/OTUs丰度的遗传力（h2）。根据F6 (≥0.15 )、F7 (≥0.15 )以及F6和F7 (≥0.10 ) 中的一致h2估计，建立了55个最可能遗传的taxa/ OTU。其中包括D240粪便中的弯曲菌目、D25粪便中的类杆菌属和53个OTU，其中2个(D240 , CC )隶属于Christensenellaceae，5个隶属于瘤胃球菌科 (4x D240 , CC )，1个( D25 )隶属于瘤胃球菌，1个( D25 )隶属于Phascolarctobacterium，1个( D240 )隶属于RF32。除RF32外，所有这些都属于Clostridiales。最高遗传力可达0.598 （YRC22属），450个可遗传的细菌分类在F6和F7两个世代中被重复验证，并且部分可遗传的细菌分类与人类肠道中的研究结果相一致，如Christensenellaece在人和猪中都具有高的遗传力，由此证明肠道菌群的组成是可以遗传的。

两个世代家猪嵌合家系中微生物群组成与丰度的遗传力。（a） 全基因组亲缘关系（Θ）与微生物组差异（Bray-Curtis距离）之间的相关性。

三、一种影响丹毒丝菌物种的miQTL

       遗传力可以量化加性遗传变异的比例，但不能预测遗传结构：遗传力低的表型可能受主效变异的影响，而高度遗传的性状可能是多基因的。为深入了解该种群肠道菌群组成的遗传结构，基于两个世代全基因组重测序数据，作者对检测到的8490个细菌分类进行GWAS研究，共检测到1527个显著变异位点，miQTL影响最显著的是丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）（两个OTU（OTU476和OTU327）以及OTU476所属的p-75-a5属）。

一种影响丹毒丝菌物种的miQTL。（a）OTU476的F6和F7全基因组荟萃分析（跨样本类型）;F6和F7中OTU476和OTU327的局部图(chr 1: 272.8-273Mb)；（c）先导SNP 1_272907239和8490个 OTUs关联性log(1/p-values)；（d）F6和F7中四个先导SNP和2.3Kb ABO缺失之间的连锁不平衡（r²）。

四、猪ABO同源基因中一个3.5 MY-old缺失导致miQTL

       所有先导SNP均定位于猪N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因的3’端，该基因也是人类ABO血型的调控基因。猪ABO血型系统中一个350万年前包含第8外显子的2.3kb缺失变异。我们表面它与本研究种群处于近乎完美的LD（r2≥ 0.94），确认其边界，表明它是由SINEs之间的染色体内重组引起的。

通过对300个F7盲肠样本的RNA-Seq和eQTL分析表明，该2.3kb的缺失突变导致ABO血型基因的7.4Kb转录本（具有可变第8和第9外显子）表达量减少（约为正常转录本的1/3），该转录本编码的蛋白质丢失了62%的氨基酸序列，包括7/8个活性位点。结果表明，2.3Kb缺失产生了一个空等位基因( 此后称为 ' O '等位基因 )，是导致miQTL突变的非常强的候选基因。

对嵌合家系61只F0家猪、18只野猪（9只亚洲野猪，9只欧洲野猪）、苏门答腊的印尼野猪、菲律宾维萨扬疣猪、印度尼西亚爪哇疣猪和非洲普通疣猪的ABO基因2.3kb缺失进行溯源分析。所有样本中的缺失断点序列均相同，证实猪属中的这个ABO基因2.3kb缺失属于古老突变并且存在平衡选择，在2.3 Kb缺失时，群体分化显著下降（图4d）。

猪ABO同源基因中一个3.5 MY-old的的缺失导致miQTL。（a）猪AO血型基因的结构；（b）AO基因型（AA、AO或OO）对OTU476丰度的影响；

（c）以2.3Kb缺失为中心的5-Kb窗口中，基于14只AA和34只OO动物之间序列相似性的UPGMA树状图；（d）群体分化减少的峰值与猪AO基因（蓝色）中2.3 Kb的缺失（红色）一致。

五、miQTL影响盲肠GalNAc浓度

       与人类一样，猪AO基因广泛表达，特别是在肠道中。A等位基因编码的N -乙酰半乳糖胺转移酶将N -乙酰- D-半乳糖胺(GalNAc， α1-3 linkage)添加到可被肠道细菌用作碳源的高度糖基化粘蛋白上。作者推断，由于肠道粘液丰富，“O”等位基因可能会降低肠道中GalNAc的浓度，从而减少依赖于这种糖的细菌的生长。

       使用LC-MS/MS法测定了278只D240猪盲肠内容物中N-乙酰半乳糖胺浓度，证实ABO血型显著影响肠道中N-乙酰半乳糖胺浓度。分析盲肠中N-乙酰半乳糖胺浓度和受ABO血型影响的丹毒丝菌科相关细菌丰度的关联性，发现即使是在同一种基因型的个体间盲肠内容物中N-乙酰半乳糖胺浓度和丹毒丝菌科相关细菌丰度仍显著相关。证明了AO基因型会影响肠道中GalNAc浓度从而影响某些丹毒丝菌科物种的丰度。

miQTL通过增加GalNAc浓度来影响利用GalNAc的细菌。（a）AO基因型对盲肠内容物中GalNAc浓度的影响（nAA=33，nAO=118，nOO=127）;（b）GalNAc浓度与“AO基因型内”OTU476丰度之间的相关性;（c）AO基因型染色;（d）OTU476样菌株的GalNAc转运和分解代谢途径;

（e）GC-MS测定喂食13C标记（红色）与常规GalNAc（绿色）的OTU476样菌株（4-8-110）中13C标记代谢物的比例。（f）体内（无菌小鼠）大肠杆菌与OTU476样菌株竞争（含和不含GalNAc）。

六、miQTL反应菌利用GalNAc

       作为肠道细菌的碳源，GalNAc需要( i )通过分泌糖苷水解酶( GHs )从糖链结构中释放，( ii )通过转运系统( TR )跨膜转运，( iii )通过特定的分解代谢途径( CP )转化为中枢代谢的中间产物。虽然有些细菌对特定单糖同时具有 GHs和TR / CP，但另一些细菌只具有 GHs(“供体”)或TR / CP (“受体”)。作者推断：对miQTL有反应的细菌会有一个完整的GalNAc TR /CP系统（有或没有GHs）。

       为了验证这一点，作者从家猪中分离培养了两株与受ABO血型影响的丹毒丝科相关细菌OTU476序列相似性分别为100%和99.8%的菌株（4-8-110和4-15-1），进行三代测序获得全基因组序列。利用宏基因组测序对92份猪肠样本构建了3111个宏基因组组装基因组（MAG），其中包括248个丹毒丝菌科。整理了24个与GalNAc利用相关的基因( TR / CP )，包括11个与N-乙酰半乳糖胺转运相关基因、2个GalNAc-6P去乙酰酶基因、2个六磷酸半乳糖胺异构酶/脱氨酶基因、3个六磷酸塔格糖激酶基因、4个1,6-二磷酸塔格糖醛缩酶基因和2个调节阻遏蛋白基因，共计6个必需通路组分( 图 5d )，在两个OTU476菌株基因组和3111个MAG中搜索了24个基因的直系同源物。发现与GalNAc转运和代谢相关的基因倾向于聚集并形成潜在共调节基因的（调节子）操纵子。通过计算和比较代谢通路值和调节子值评估细菌物种利用GalNAc的能力，发现受ABO血型影响的丹毒丝菌科菌株具有更完整的GalNAc转运和代谢通路，且代谢通路基因形成操纵子样基因簇，其它丹毒丝菌次之，而在其他MAG（n=2863）中仅发现了2.9%。

       为了确认OTU476样菌株能够导入和分解GalNAc，作者使用13C标记GalNAc饲喂体外培养的受ABO血型影响的丹毒丝菌科菌株4-8-110，在培养13小时后收集菌体培养物进行13C标记的代谢物GC-MS测定，发现GalNAc的代谢产物3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮都被C13标记，证实了受ABO血型影响的丹毒丝菌科菌株4-8-110能够利用GalNAc。

       进一步在无菌小鼠中进行灌胃实验，以测试在体内添加GalNAc对4-8-110和大肠杆菌相对生长的影响。对大肠杆菌和丹毒丝科4-8-110菌株的混合物灌喂小鼠再次用GalNAc（200mg /kg：与AA猪相当的盲肠GalNAc浓度）或对照PBS分别灌喂。12d取小鼠盲肠和粪便进行16S rRNA测序测定大肠杆菌和4-8-110的相对丰度。结果表明添加GalNAc会显著影响肠道中丹毒丝菌科相关细菌丰度，而对照的大肠杆菌丰度则不受影响。

七、miQTL敏感细菌的GalNAc操纵子

       研究表明与大肠杆菌和其他物种相反，OTU476菌株和一些丹毒丝菌科细菌不能感知GalNAc的浓度，只能在需要时诱导GalNAc利用所需基因的表达，而可能是组成性表达这些基因。为了验证这一假设，在培养基中培养了两株受ABO血型影响的丹毒丝菌科菌株OTU476和有无GalNAc的大肠杆菌进行菌株转录组分析。OTU476菌株与GalNAc转运和代谢相关的操纵子样基因簇一直处于表达状态，与是否添加N-乙酰半乳糖胺GalNAc诱导无关；而对照组的大肠杆菌菌株则是在添加N-乙酰半乳糖胺GalNAc诱导后表达。

miQTL反应细菌的GalNAc操纵子组织和转录组反应。（a）OTU476样菌株和大肠杆菌中GalNAc操纵子的组织和添加GalNAc后的局部转录组反应;（b）OTU476样菌株和大肠杆菌对GalNAc添加的全局转录组反应

总结

        该项目通过对两个世代1500多个个体，每个个体三个生长阶段和三个肠道部位大量样本系统研究，绘制了一个影响Erysipelotrichaceae（丹毒丝菌）物种丰度的数量性状基因座，并表明它是由支持人类 ABO 血型的 N-乙酰-半乳糖胺基转移酶基因中的 2.3-Kb 缺失引起的。该缺失是平衡选择下≥350 万年的跨物种多态性。有力证明宿主遗传会影响肠道菌群的组成和丰度。发现并验证这项工作中报告的miQTL“简单”通过影响肠道GalNAc浓度，从而影响GalNAc利用细菌的生长。