小分子改造|中药麦冬为什么能清心润肺？
发布日期：2022-05-26 浏览次数：2837
鲁斯可皂苷元通过靶向NMMHC IIA 调节TLR4信号改善LPS诱导的肺内皮屏障功能障碍
2021年12月7日，中国药科大学中药学院寇俊萍教授团队在药学期刊Acta Pharmaceutica Sinica B（IF：11.614）上在线发表了一篇题为“Ruscogenin alleviates LPS-triggered pulmonary endothelial barrier dysfunction through targeting NMMHC IIA to modulate TLR4 signaling”的研究论文。该研究通过设计合成的中药麦冬活性成分鲁斯可皂苷元（RUS）的活性小分子探针，揭示了RUS防治急性肺损伤的作用靶点，为临床防治急性肺损伤以及内皮屏障功能障碍相关疾病提供潜在新靶点和可能的候选药物，也为阐释中药麦冬滋阴润肺的科学内涵提供药理学依据，为探索中药药理原创机制提供了思路和方法借鉴。
背景：
急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）常因严重的细菌、病毒感染、休克、创伤等因素所导致，严重者可发展为急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS），后期可并发多器官衰竭和脓毒血症，具有高发病率与高死亡率的特点。肺血管内皮屏障功能障碍为急性肺损伤最根本的病理生理特征。当肺部受到感染时，肺血管内皮通透性显著增加导致肺血管周围浆液渗出形成肺水肿，同时大量白细胞浸润，纤维蛋白沉积，进而引起低血氧呼吸窘迫。
非肌肉肌球蛋白II是维持细胞内环境稳定所必需的运动蛋白，参与多种细胞功能。Myh9编码的非肌肉肌球蛋白重链IIA(NMMHC IIA)是分布最广泛的非肌肉肌球蛋白II亚型。研究表明，NMMHC IIA在调节内皮功能方面发挥着重要作用。然而，NMMHC IIA在脂多糖(LPS)诱导的ALI和肺内皮屏障功能障碍中的作用及其药理干预作用研究仍然有限。
中药麦冬具有养阴生津，润肺清心的功效。其有效活性成分鲁斯可皂苷元（RUS）具有显著的抗炎、抗血栓、保护血管内皮等药理作用。已有研究发现RUS对ALI具有显著的保护作用。先前的研究发现，RUS通过调节Toll样受体4(TLR4)信号转导，对脂多糖诱导的肺损伤和内皮细胞凋亡具有保护作用，提示TLR4可能在RUS的抗炎和抗凋亡作用中起重要作用。然而，RUS是否直接作用于TLR4或TLR4复合体来调节下游信号，还有待进一步研究。
该研究旨在探讨RUS对内毒素诱导的ALI时肺内皮细胞屏障功能障碍的影响及其机制。该研究通过RUS活性小分子探针捕获了其靶蛋白NMMHC IIA，并发现RUS直接与NMMHC IIA的N-末端和头域结合，介导NMMHC IIA-TLR4相互作用，抑制Src/VE-cadherin(VE-cadherin)信号的激活，从而对抗内毒素诱导的肺内皮屏障破坏，提示RUS可能是治疗ALI的一种有前途的候选药物。
研究思路：
1、体内和体外实验验证RUS改善内毒素触发的肺血管内皮屏障破坏；
2、通过RUS活性探针（亲和介质）富集其特异结合蛋白，并通过质谱和WB实验证实为NMMHC IIA；
3、分子对接技术分析RUS与NMMHC IIA的结合位点；
4、MST和BLI分析证实MMHC IIA是RUS的靶蛋白，RUS主要与其头部结构域结合；
5、NMMHC IIA在内毒素诱导的TLR4/Src/VE-cadherin信号通路中的作用的确定；
6、NMMHC IIA基因敲除实验表明NMMHC IIA在内毒素诱导的肺血管渗漏的作用；
7、染料渗漏分析验证NMMHC IIA在RUS对内毒素诱导的肺内皮屏障功能障碍的调节中的作用；
8、确定NMMHC IIA与TLR4的相互作用及作用位点；
9、RUS在NMMHC IIA-TLR4互作及其信号通路中的作用。
实验结果：
1、RUS在体内和体外改善内毒素触发的肺血管内皮屏障破坏
小鼠气管内注入脂多糖6h后，肺切HE染色可见明显病变，而RUS(0.3和1 mg/kg)和地塞米松治疗组肺组织病变明显改善(上图A和B)。与ALI模型组相比，RUS干预组BALF中总蛋白水平和白细胞计数均显著降低(上图C和D)。EBA渗漏分析实验表明RUS减轻了内毒素诱导的肺血管渗漏（上图E和F）。RUS能显著降低内毒素血症小鼠的死亡率，延长小鼠存活。这些结果表明RUS可以改善内毒素刺激的肺血管高通透性。
同时，TER和EBA渗漏分析表明，LPS刺激显著降低了MLECs的TER值，增加了EBA的渗漏，而RUS处理改善了LPS诱导的MLECs的高通透性(上图H和图I)。免疫染色实验还表明，RUS对脂多糖刺激的细胞骨架排列紊乱和相邻MLEC之间VE-cadherin结构的破坏有改善作用(上图G)。
上述结果证实了RUS对内毒素诱导的肺内皮细胞屏障功能障碍和急性肺损伤的保护作用。
2、RUS直接与NMMHC IIA的N-末端和头域结合
使用RUS亲和介质，通过亲和层析从HUVEC裂解物中获得了RUS的特异性结合蛋白（上图A），并通过质谱和Western印迹分析表明其为NMMHC IIA。分子对接研究表明RUS与NMMHC IIA(上图B)的头部结构域结合，与Pro521、Pro522、Gly523、Ala526、Leu527、Glu530、Glu531、Gln550、Glu549和Lys545等残基结合(上图C)。此外，通过MST分析确定了RUS与全长NMMHC IIA在体外的相互作用(上图D)。
NMMHC IIA不同结构域的MST分析表明，RUS与NMMHC IIA的N末端和头部结构域结合(上图A-D)。BLI分析检测RUS和NMMHC IIA结构域的体外亲和力。结果表明，RUS以正向剂量依赖的方式与NMMHC IIA头部结构域直接相互作用(上图E)。
上述结果表明，NMMHC IIA是RUS的靶蛋白，RUS主要与其头部结构域结合，介导NMMHC IIA的生物学功能。
3、内毒素刺激导致肺内皮细胞NMMHC IIA表达增加和VE-cadherin降解
然后开始确定NMMHC IIA在内毒素诱导的ALI小鼠模型中的作用。免疫组织化学染色显示，内毒素刺激后6h，肺内皮细胞NMMHC IIA表达显著增加(上图A和E)。在内毒素治疗后，TLR4和下游磷酸化的Src水平都有所提高(上图B、C、F和G)。脂多糖处理后，VE-cadherin水平下调(上图D和H)。这些发现提示内毒素暴露通过激活TLR4/Src/VE-cadherin信号通路破坏肺内皮细胞黏附连接，NMMHC IIA可能在此过程中起关键作用。
4、内皮NMMHC IIA单等位基因缺失对内毒素诱导的肺血管渗漏的影响
由于完整的NMMHC IIA基因敲除小鼠不能发育正常的内脏内胚层，该研究构建了EC特异性NMMHC IIA单等位基因缺失(Myh9fl/wt;Tek-Cre)小鼠用于后续实验。免疫染色（上图A）和WB实验（上图B）证实了NMMHC IIA在MLEC中的表达降低约50%。肺切片H&E染色显示Myh9fl/wt;Tek-Cre小鼠无明显异常，而Myh9;Tek-Cre小鼠在脂多糖刺激后表现出明显的肺部病变(上图C)。脂多糖刺激Myh9+/+;Tek-Cre小鼠肺中炎症标志物MPO水平的显著升高，而Myh9fl/wt;Tek-Cre小鼠肺中MPO水平显著改善(上图图D)。EBA渗漏分析表明，Myh9fl/wt;Tek-Cre小鼠在脂多糖诱导的肺血管高通透性方面表现出改善(上图E)，这与肺组织中白蛋白的免疫染色(上图F)一致。WB结果显示，Myh9fl/wt;Tek-Cre小鼠内毒素损伤后VE-cadherin和p120-catenin水平明显恢复(上图G和H)。这些结果支持抑制内皮细胞NMMHC IIA可改善内毒素诱导的小鼠肺血管内皮细胞屏障的破坏。
5、NMMHC IIA介导RUS对肺内皮细胞屏障功能的保护作用
用Myh9fl/wt;Tek-Cre小鼠验证RUS是否通过NMMHC IIA调节内皮屏障的完整性。内皮NMMHC IIA缺陷显著抑制了脂多糖诱导的BALF中总蛋白含量、白细胞计数和单核细胞百分比的增加，但RUS介导的改善在脂多糖损伤后的Myh9fl/wt;Tek-Cre小鼠中被取消。TER和EBA渗漏分析表明，NMMHC IIA基因敲除抵消了RUS对内皮屏障功能的保护作用(上图A和B)。WB结果也表明，NMMHC IIA干扰取消了RUS对LPS诱导的TLR4途径激活的调节(上图C-F)。这些数据支持NMMHC IIA在RUS对内毒素诱导的肺内皮屏障功能障碍的调节作用中起关键作用。
6、脂多糖诱导NMMHC IIA从TLR4的解离
NMMHC IIA与TLR4相互作用，并通过介导下游转导通路调节脑内皮细胞的紧密连接。该研究使用PLA18双链来检测内毒素刺激后NMMHC IIA和TLR4之间的关系。结果表明，内毒素刺激24小时后，肺内皮细胞中NMMHC IIA与TLR4逐渐解离(上图A和B)。在MLEC中，内毒素诱导的NMMHC IIA在5分钟内迅速从TLR4中解离(上图C和D)，支持NMMHC IIA参与TLR4信号转导。
为了进一步探索NMMHC IIA与TLR4相互作用调节下游信号的机制，分子对接分析发现，NMMHC IIA的头部结构域显示出与TLR4结合的最高可能性(上图A和B)。将GFP标记的NMMHC IIA结构域和Myc标记的TLR4表达载体共转染HEK293T细胞。co-IP结果表明N末端和头部结构域与TLR4有很强的结合，但其他结构域不与TLR4结合(上图C)。BLI结果表明，TLR4与NMMHC IIA头域直接相互作用(上图D)。为了鉴定NMMHC IIA的N-末端和头部结构域中的特定相互作用位点，该研究构建了N-末端的2个突变体和头部区域的5个突变体。精确定位了参与NMHC IIA-TLR4相互作用的残基（上图E和F）。
7、RUS通过调节NMMHC IIA-TLR4相互作用抑制内毒素诱导的TLR4/Src/VE-cadherin信号的激活
该研究在体内使用PLA法来确定RUS对NMMHC IIA-TLR4相互作用的调节作用(上图)。结果表明RUS显著阻止内毒素刺激的NMMHC IIA与肺内皮细胞TLR4的解离(上图A和D)。MLECs中的免疫荧光共定位、co-IP和PLA分析表明，RUS有效地逆转了内毒素刺激的MLECs中NMMHC IIA和TLR4之间的破坏性相互作用(上图B，C，E和F)。WB结果表明，RUS对NMMHC IIA和内毒素诱导的TLR4/Src/VE-cadherin信号通路的激活有抑制作用(上图G-J)。上述结果表明，RUS通过稳定NMMHC IIA-TLR4相互作用，抑制了脂多糖诱导的TLR4信号的激活。
讨论：
肺血管通透性增加，导致肺泡充满蛋白液体和肺水肿，是ALI/ARDS3的特征。该研究发现天然产物RUS通过改善肺内皮细胞的高通透性而对ALI起到明显的保护作用。通过系列亲和层析、生物层析干涉、微量热电泳法和内皮特异性敲除实验，确定NMMHC IIA是RUS的直接结合靶点，RUS通过靶向NMMHC IIA N端和头部结构域调节NMMHC IIA-TLR4相互作用，从而减轻脂多糖诱导的内皮屏障破坏。该研究表明天然甾体皂苷元RUS可能是一种潜在的NMMHC IIA抑制剂；NMMHC IIA可能是保护内皮屏障破坏和RUS对抗内毒素诱导的ALI的潜在靶点。
该研究丰富了急性肺损伤的病理机制，揭示了中药活性成分RUS防治急性肺损伤的作用靶点，为临床防治急性肺损伤以及内皮屏障功能障碍相关疾病提供潜在新靶点和可能的候选药物，也为阐释中药麦冬滋阴润肺的科学内涵提供药理学依据，为探索中药药理原创机制提供了思路和方法借鉴。
小编语：
活性小分子探针可以有效筛选对应化合物的特异性结合蛋白，大大减少了蛋白靶标筛选的范围。完整的蛋白靶标功能鉴定和作用通路的阐述，可以有效的解释药物活性成分治疗疾病的机制，也是发表高水平文章的关键。该研究为药物药理研究提供了很好的思路和方法借鉴。
