Environment DNA |使用环境DNA对淡水鱼类群落进行生物监测：与北方水电蓄水库中已建立的刺网调查的比较

Environment DNA |使用环境DNA对淡水鱼类群落进行生物监测：与北方水电蓄水库中已建立的刺网调查的比较

        发表期刊：Environment DNA

       发表时间：2020.9

       原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/edn3.135

1 研究背景

       保护和管理野生动物的一个基本目标是进行有效的生物多样性监测，以获得关于物种的分布和丰度，这在水生栖息地的人为改造背景下尤其重要。传统的方法是基于捕获和形态鉴定的刺网法，然而因其所需物质和人力资源成本较高，存在个体偏差，可能会导致鱼类死亡等因素，迫切需要开发更准确、可靠、无创和更便宜的监测工具，以快速评估鱼类群落，以更好地指导管理和保护策略。

       环境DNA(eDNA) 是生物体在生长活动时，存在于体内细胞、组织、血液或者体外粪便、尿液等释放到环境中的DNA。eDNA可以被用作代替传统刺网法的一种监测工具，且监测数据更准确。水样eDNA最常用的两种监测方法是：1、实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)以检测和估计目标物种的数量；2、宏条形码，包括使用针对分类群的“通用引物”结合高通量测序来扩增整个群落的 DNA恢复物种组成。本文研究是通过从eDNA获得的宏条形码作为鱼类丰度或生物量的代表的定量潜力与传统刺网法进行对比。

2 材料和方法

2.1、刺网调查

       在鲁珀特河（加拿大詹姆斯湾）水电蓄水库的17个地点进行了实验性刺网调查(图1，表1)，每个采样点的捕捞工作量为 24 小时。

图1 加拿大詹姆斯湾鲁珀特河系统的采样点

2.2、eDNA采样、过滤、提取

       在布网之前，在17个取样点中的每个取样点使用两个不同的Niskin采水瓶（每个样品4升）采集两个相同的生物重复水样。测量了每个站点的非生物（pH值、浊度、溶解氧、温度、深度）和生物（α-叶绿素）水特征，以评估这些因素对eDNA浓度的可能影响（表1）。

分别使用真空泵和活塞注射器在1.2微米和0.7微米的玻璃纤维过滤器上过滤（图2）。由于操作失误，其中六个注射器过滤器在提取DNA步骤中被氯仿污染。这六个样品（EM356A、RP030B、RP042B、RP114A、RP116A和RP220A）已被删除，涉及注射器的进一步分析是基于11个采样点。

表1 采样位置和物理化学水参数的 GPS 定位

图2 实验设计总结

2.3、宏条形码与qPCR

       使用"Mifish "通用引物，每个样本和每个采样点的PCR空白都进行了5次扩增复制，考虑到通过PCR步骤的污染，循环条件如下。(i) 95°C 15分钟；(ii) 94°C 30秒；(iii) 65°C 90秒；(iv) 72°C 60秒；(v) 重复步骤(ii)-(iv)，再循环34次；(vi) 72°C 10分钟；并保持在12°C。用Qubit荧光仪对所有64个样本（包括15个现场阴性对照和4个实验室阴性对照）进行量化，归一化，使用双端300 bp进行Illumina MiSeq测序。

使用海鱼特异性 "ND2 "qPCR引物，每个样品进行了六个技术重复。对于每个单独的qPCR反应，使用了2微升样品DNA；10微升TaqMan Environmental Master Mix 2.0；1.8微升正向和反向引物（10微米）；0.5微升探针，与由1.2微升SPUD正向和SPUD反向引物组成的SPUD反应混合；0.5微升SPUD探针；和1微升SPUD模板。

2.4、生物信息学

      移除Mifish引物序列和Illumina接头，并使用MiSeq Control软件v2.3版对原始测序读数进行拆分。然后使用Barque pipeline v1.5.1（https://github.com/enormandeau/barque）对原始数据进行分析。使用mitofish 12S数据库（http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/），辅以自制的鱼类12S序列数据库（https://github. com/enormandeau/barque），在物种水平上具有97%-100%匹配的reads被保留下来用于进一步分析。在阴性对照中检测到的物种的reads被认为是潜在的污染，reads的数量被减去相关样品中物种的相应reads数量。最后，确保所有进一步分析的物种都存在于两个生物重复中，目的是将假阳性的可能性降到最低。

2.5、统计分析

所有的统计分析都是用R（3.4.3版），主要是用vegan包进行的。物种丰富度比较的积累曲线是用函数 "specaccum "功能完成的。用函数 "chisq.test "进行卡方（χ2）检验；使用函数 "mantel"对所有成对的eDNA方法进行了多重Mantel相关检验；使用非度量多维缩放法（nMDS）来可视化不同方法所描绘的鱼类群落；使用Bray-Curtis距离比较不同的群落；然后进行多变量分析（PERMANOVA）来统计评估关联的强度；进行相似度百分比分析（SIMPER），结果用函数"envfit "功能在MDS排序上进行了直观表示；对刺网的丰度（CPUE）和生物量（BPUE）数据进行了回归分析；最后，使用偏冗余分析 (pRDA) 评估环境参数对eDNA读数的影响。

3 结果

3.1、序列质量

       在Illumina MiSeq平台上的一次运行中，总共获得了11,459,443条reads，包括所有64个样品。在使用Barque流水线进行过滤步骤后，8,672,220条reads被分配给100%匹配的鱼类物种，而2,787,223条未分配。

       鉴于几乎所有的鱼类序列都可以被识别，而且只观察到极少的分类不确定性，我们达到了准确的分类分辨率；即与Salvelinus alpinus（北极嘉鱼Arctic charr）相关的14条reads被放弃了进一步的分析，因为在鲁珀特河系统中从来没有报道过这种鱼类。由于回收的reads数量极少，更有可能的是这些reads代表了与密切相关的S. namaycush（湖鳟鱼lake trout）的测序错误，这种鱼只有一个核苷酸的差异，并且在研究地区被捕获过。同样，Cottus bairdi（斑点杜父鱼）和C. cognatus（杜父鱼），两个已知出现在这些纬度的常见鱼种，不能被12S MiFish标记所区分，因此被视为单一的分类群。另外，MiFish不能区分Oncorhynchus太平洋鲑属中的四个物种。因此，我们将相关reads归为Oncorhynchus sp。

       然而，O. mykiss（虹鳟rainbow trout；整个北美东部的引进物种）是唯一在我们的研究区域发现的Oncorhynchus。然而，由于它从未在鲁珀特河系统中被记录过，而且它只出现在一个地点和一个泵的重复中（地点RP042B重复B），我们认为这些reads是一种污染，并从进一步的分析中丢弃它们，即使reads的数量很高（71 132读数）。最后，在两个不同的采样地点检测到82个白鲈鱼（Morone americana）的读数。在魁北克省，该物种只出现在圣劳伦斯河，因此也被认为是污染。一些哺乳动物（驼鹿。驼鹿：Alces alces，牛：Bos Taurus，人：Homo。一些哺乳动物（驼鹿：Alces alces，牛：Bos Taurus，人类：Homo sapiens，和猪：Sus scofa）和北方双线螈（Eurycea bislineata）也被检测到。总体而言，我们采用了一种保守的方法来消除可能的污染偏差，方法是在每个采样点添加过滤空白（现场阴性对照），并在相应空白的两个重复中减去空白中发现的reads数。由于RP115A站点的过滤空白的污染程度较高（199,274个reads），我们将其排除在进一步分析之外。在排除了这个采样点后，过滤空白的全球污染只占读数的0.5%（包括在内时为2.7%）。我们对其他16个采样点进行了去除污染和不去除污染的所有统计分析，得到了非常相似的结果，没有对我们的主要解释进行任何修改，这表明总体的低污染水平对本研究的主要结果没有影响。宏条形码和刺网捕获的原始数据在数据S1中提供。

3.2、物种丰富度比较

综合所有方法，在研究区域内共检测到20个物种，其中只有10个是由刺网捕获的，而两种eDNA采集方法都检测到了所有的物种。然而，250毫升注射器法漏掉了泵滤法和刺网法都检测到的频率很低的两个物种（Acipenser fulvescens：黄鲟鱼lake sturgeon；S. namaycush：湖鳟鱼lake trout）。有3个物种只在泵滤法中被检测到（Notropis atherinoides: emerald shiner；Rhinichthys cataractae: Longnose Dace；以及S. fontinalis：Brook Charr）。在整个研究区域范围内，没有任何物种专门被刺网完全探测到。然而，在采样点层面，两种eDNA采样方法都遗漏了两个被刺网捕获的物种（假阴性）：RP062B站点的湖鳟lake trout和RP014A站点的湖鲟lake sturgeon（图3）。当考虑到采样工作时，积累曲线（图4）显示，两种eDNA宏条形码方法在大约11个采样点时都达到了平稳状态（图4）。相比之下，刺网没有达到稳定水平，甚至在预测曲线（虚线）上也是如此，因此表明与eDNA相比，抽样不足以检测群落中存在的所有鱼类。eDNA泵重复（VAC-1和VAC2）之间的曲线模式非常相似，描绘出最高的鱼类多样性。注射器方法也达到了平稳状态，但检测到的物种比泵方法少，这可以解释为注射器过滤的水量较小（注射器：250毫升；泵：1升），也可能是由于采样地点较少（11个地点而不是17个）。

图3刺网、eDNA泵和eDNA注射器的17个采样点发现的物种的相对丰度热图

图4 积累曲线，eDNA 过滤泵法（蓝色为 VAC-1，紫色为 VAC-2）、eDNA 注射器法（绿色）和刺网捕获的 CPUE（红色）。实线表示采样位置的数量，虚线表示基于 1,000 次迭代模拟 50 个站点的推断站点

3.3、扩增偏差评估和生物重复比较

在对模拟群落进行测序后，没有观察到扩增的偏差。事实上，模拟群落中五个物种的DNA比例在测序后产生了相同比例的读数(图S1)。扩增偏差主要由引物和目标扩增子之间的错配数量驱动。在这里，用Geneious软件检查本研究中恢复的20个物种的12S序列，发现没有一个物种的序列与引物的序列之间有一个以上的错配，而且都发生在同一个胞嘧啶位置。这表明，虽然不能完全排除，但我们的研究系统中的扩增偏差不应该对我们的结果和解释产生重大影响。

图5 泵的17个采样点和注射器11个采样点相对于物种频率的序列读数数量

3.4、qPCR与宏条形码

在实验室阴性对照中没有检测到扩增，而所有阳性对照都有扩增，SPUD在所有样品中都显示出持续扩增，从而证实了没有抑制作用。对于六个标准曲线的结果度量，斜率在-3.384到-3.491之间（平均=-3.44，SD=0.04），R2在0.998到1之间（平均=0.999，SD=0.0008）。通过qPCR测量的白眼鱼eDNA浓度由六个技术重复中的阳性扩增平均值来说明，然后进行对数转换。散点图显示，qPCR浓度与白眼鱼宏条形码序列读数之间有很强的关联（r = 0.78，p < .001；图S2）。

3.5、社区层面eDNA和刺网捕获之间的相对丰度

为了比较不同物种在群落层面的相对丰度，我们使用了刺网和宏条形码检测到的10个物种。nMDS排序显示各方法之间有适度的重叠（全局PERMANOVA；R2=0.35；P<0.001），表明相对丰度的重要部分在它们之间存在差异（图6）。基于Bray-Curtis异质性对每个物种的标准化相对序列读数丰度进行的成对PERMANOVA比较显示，泵重复之间没有显著差异（F = 0.53; p = . 7 4），注射器和泵的重复（泵A：F = 0.14，p = .97；泵B：F = 0.29；p = .90），以及CPUE与BPUE（F = 1.38；p = .24）之间也没有显著差异，而eDNA方法与刺网之间的所有其他比较都有明显差异（表2）。此外，结果显示，eDNA方法产生了类似的结果，eDNA宏条形码和刺网捕捉到了明显不同的鱼类群落画像（图3）。这也被SIMPER分析所证实，由metabarcoding序列读数确定的金鲈Yellow Perch和Cisco（湖白鲑Coregonus artedi）的相对丰度相对于刺网数据明显较高，而对白眼鱼的观察则相反（图6）。事实上，与刺网相比，两种eDNA宏条形码方法都描述了群落组成的更多变化和复杂性。

表2基于标准化相对丰度的Bray-Curtis差异的成对 PERMANOVA

图6 所有方法共有的10个物种组成的鱼类群落的基于Bray-Curtis距离的NMDS排序

3.6、eDNA序列读数与刺网捕获量在物种层面的相关性

对刺网捕鱼数量高于20条的4个丰度物种（白眼鱼Walleye、白鲑鱼Lake Whitefish、白亚口鱼White sucker、白斑狗鱼Northern pike）进行了测试，以了解序列读数/物种数量（来自泵法）与刺网捕鱼之间的关联。白眼鱼Walleye和白亚口鱼White sucker显示出序列读数/种类的数量与丰度（CPUE）之间的相关性比与生物量的相关性更强（图7）。白鲑鱼Lake Whitefish在eDNA与CPUE或生物量之间显示出类似的相关水平（图7）。白斑狗鱼Northern pike没有观察到明显的相关关系。从注射器方法获得的序列读数/物种数量与丰度（CPUE）或生物量之间没有观察到明显的相关性。

图7 三个物种的序列读数（宏条形码数据）与鱼类丰度 (CPUE) 或生物量之间的关系

3.7、环境因素

pRDA显示，在控制了刺网观察到的鱼类丰度（CPUE）变化后，18%的eDNA变化被pH值（p=0.005）、α-叶绿素（p=0.04）和溶解氧（p=0.029）的综合影响所解释（全球模型意义：adj.R2=0.18；p<0.001；图8）。因此，pH值、α-叶绿素和溶解氧是影响特定刺网丰度和宏条形码eDNA读数之间相关性的潜在候选因素。

图8 偏冗余分析的三重图

4 总结

4.1、eDNA 宏条形码可以检测更高的物种丰富度

       通过对宏条形码和既定的实验性刺网调查进行了直接比较，eDNA宏条形码可以在大多数采样地点检测到许多被刺网调查完全忽略的物种。

4.2、未检测到扩增偏差

       通过构建了模拟群落，使用刺网调查的五个最丰富的物种以1:5的比例组成，对五个重复进行了测序。结果表明，在所有的重复中，DNA的初始比例和测序后的读数比例之间没有发现差异。

4.3、eDNA 样品重复的高重现性

       在每个地点使用两个不同的Niskin瓶收集了2L水样的真正的生物重复，并使用泵过滤法进行过滤。还通过使用无菌注射器从第一个Niskin瓶中过滤了第三个250毫升的水样。然后对每个采样点的样品分别进行测序和分析。结果显示，样品重复之间有很高的重现性。

4.4、eDNA 宏条形码读数和 qPCR 之间的强定量一致性

       鉴于水生环境中大多数eDNA的丰度推断来自于qPCR分析，而对eDNA宏条形码提供的定量分辨率知之甚少。分析显示，对于系统中最丰富的物种，白眼鱼，qPCR和宏条形码之间有很强的关联性。此外，qPCR与CPUE或BPUE之间的关系与宏条形码观察到的相似。这些结果表明，至少在某些情况下，宏条形码可能具有与qPCR相同的定量分辨率。

4.5、eDNA宏条形码序列读数与刺网捕获之间的现有关联

       当我们比较10个共享物种的标准化数据的相对丰度时，我们观察到eDNA和刺网调查之间存在一些差异。尽管存在这些差异，我们还发现使用泵法的四个物种中，三个最丰富的物种的eDNA序列读数随着鱼类丰度的增加而有统计学意义，从而进一步证明eDNA宏条形码在某些情况下可以用来获得一些相对丰度的定量信息。

4.6、环境因素对eDNA宏条形码读数的影响

       使用偏冗余分析（pRDA），我们发现pH值、α-叶绿素和溶解氧在控制了刺网中鱼类丰度的变化后，解释了18%的eDNA读数分布差异。这些变量可以部分解释刺网和eDNA宏条形码在反映鱼类群落的组成和相对丰度方面的差异。α-叶绿素是水生环境中最常用的初级生产代表。更高产的环境可以通过增加使用eDNA作为能量来源的微生物的存在而潜在地影响eDNA的降解。溶解氧可以调节水生生物对其环境的生理耐受性，溶解氧的减少会导致缺氧。这可以调节鱼类在水体中的分布和它们的eDNA的恢复。另外，eDNA的降解随着酸度的增加而增加，尽管发现pH值对介观器中两栖动物eDNA的丰度影响很小。

        本研究提出的方法已经可以作为既定调查的补充甚至替代，其好处是可以非侵入性的更准确地检测物种，以及获得相对丰度信息的不繁琐的手段。此外，仍然需要更多的实证研究，比较eDNA宏条形码与传统捕获方法的性能，以实现eDNA宏条形码在生物监测中的标准化，以及在影响研究或政府政策等监管背景下的使用。

点评：

       环境DNA（eDNA）作为一种强大的分子工具能够无创地调查来自许多生态系统的物种丰富度，可以提供关于鱼类生物多样性的有见地的信息。环境DNA条形码可以通过针对不同物种，并克服传统取样的局限性，适用于各种环境，对物种的相对丰度进行精确估计，后续eDNA宏条码将成为一种标准的测量工具，它将补充传统方法并加速人们对全球生物多样性的理解。